王少揚(yáng) 劉海周 馬衛(wèi)閩 王賢 謝麗平 謝志紅

·論 著·

CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療慢性乙型肝炎患者Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能變化

王少揚(yáng) 劉海周 馬衛(wèi)閩 王賢 謝麗平 謝志紅

目的觀(guān)察核苷（酸）類(lèi)藥物聯(lián)合CIK治療慢性乙型肝炎患者Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能變化，為維持持久免疫應(yīng)答，減少核苷（酸）類(lèi)藥物停藥后復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。方法15例慢性乙型肝炎患者在核苷（酸）類(lèi)藥物治療達(dá)到HBV DNA檢測(cè)水平下限時(shí)給予CIK治療，分別在核苷（酸）類(lèi)藥物治療前、HBV DNA達(dá)到檢測(cè)水平下限以及CIK治療后2周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能，10例單獨(dú)接受CIK治療和10例單獨(dú)接受核苷（酸）類(lèi)藥物治療的慢性乙型肝炎患者作為對(duì)照組。結(jié)果無(wú)論是觀(guān)察組還是對(duì)照組，當(dāng)接受核苷（酸）類(lèi)藥物并HBV DNA水平達(dá)到不可檢測(cè)水平以下時(shí)，CD4細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平明顯升高（1.511±1.026 vs 2.139±0826，1.656±0.869 vs 2.511±1.133，P＜0.05），IL-4水平無(wú)明顯變化，單獨(dú)接受CIK治療后IFN-γ水平也明顯增高（1.434±0.924 vs 2.211±0.921，P＜0.05），IL-4水平無(wú)明顯變化，同前兩組比較IFN-γ水平和IL-4水平均無(wú)差異。核苷（酸）類(lèi)藥物聯(lián)合CIK治療后相比單獨(dú)CIK治療和單獨(dú)核苷（酸）類(lèi)藥物治療，不但I(xiàn)FN-γ明顯增高（3.288±0.561 vs 2.211±0.921，3.288±0.561 vs 2.511±1.133，P＜0.05），并且IL-4水平也降低（0.277±0.237 vs 0.428±0.208，0.277±0.237 vs 0.477±0.255，P＜0.05）。結(jié)論核苷（酸）類(lèi)藥物聯(lián)合CIK治療明顯提高Th1類(lèi)細(xì)胞應(yīng)答，并抑制Th2類(lèi)細(xì)胞功能，但是否持久維持Th1類(lèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答還需要進(jìn)一步研究。

乙型肝炎；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞；核苷（酸）類(lèi)藥物

核苷（酸）類(lèi)藥物是治療慢性乙型肝炎（CHB）最主要的治療措施之一，具有較強(qiáng)的抗病毒療效，但存在停藥后易復(fù)發(fā)需要長(zhǎng)期治療的局限性，提示核苷（酸）類(lèi)藥物不能維持持久的免疫應(yīng)答效應(yīng)。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK）可以提高CHB患者的免疫應(yīng)答效應(yīng)，特別是乙肝特異性CTL應(yīng)答效應(yīng)，在CHB治療中初步顯示一定的療效和潛在的應(yīng)用價(jià)值。Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞失衡，Th2類(lèi)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，導(dǎo)致特異性CTL應(yīng)答功能減弱和缺失是乙型肝炎慢性化的主要機(jī)制。為此本研究將核苷（酸）類(lèi)藥物聯(lián)合CIK治療的CHB患者為觀(guān)察對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀(guān)察Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能的變化，為維持持久免疫應(yīng)答效應(yīng)，減少核苷（酸）類(lèi)藥物停藥后復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2010年1月至2013年12月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院感染科門(mén)診或住院15例接受CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療CHB患者為觀(guān)察對(duì)象，單獨(dú)接受CIK和核苷（酸）類(lèi)藥物治療的CHB患者各10例為對(duì)照組，診斷符合2005年慢性乙型肝炎防治指南。并排除丙型肝炎、HIV感染、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和其他因素造成的肝功能異?；颊?。CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療患者15例，男性11例，女性4例，年齡34歲，平均（34±12）歲。核苷（酸）類(lèi)藥物治療10例患者中男性7例，女性3例，年齡36歲，平均（36±15）歲；單獨(dú)接受CIK治療患者10例，男性8例，女性2例，年齡32歲，平均（32±11）歲。為減少不同核苷（酸）類(lèi)藥物抗病毒治療中對(duì)患者免疫功能影響的差異，接受核苷（酸）類(lèi)藥物治療的患者均給予恩替卡韋抗病毒治療（施貴寶公司提供）。接受CIK治療患者均通過(guò)嚴(yán)格的醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，并簽訂知情同意書(shū)。

二、治療方案及臨床指標(biāo)觀(guān)察

觀(guān)察組15例患者先給予核苷（酸）類(lèi)藥物抗病毒治療，每4周檢測(cè)HBV DNA含量，HBV DNA＜500拷貝/m L時(shí)給予CIK治療，在接受核苷（酸）類(lèi)藥物治療前及CIK治療前和CIK治療后2周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能變化。單獨(dú)接受CIK治療患者在治療前及治療結(jié)束后2周檢測(cè)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能變化；核苷（酸）類(lèi)藥物治療患者在治療前和HBV DNA低于檢測(cè)下限時(shí)檢測(cè)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能變化。觀(guān)察組和對(duì)照組患者在接受治療前及治療后每4周觀(guān)察生化、CHB血清標(biāo)志物及HBV DNA含量。

三、CIK細(xì)胞的培養(yǎng)、制備和回輸

用成分血分離機(jī)采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（1～4）×109。在符合GMP認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室條件下，在不同時(shí)間加入一定劑量的重組人干擾素γ200 U/m L、IL-2 1 000 U/m L和抗CD3單克隆抗體50 ng/mL等（北京新明泰利科技有限公司提供），37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，將CIK細(xì)胞分4次隔天回輸給患者，每次的CIK細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌和重懸浮后以0.9%氯化鈉注射液制備成體積為400～500 mL的細(xì)胞懸液回輸給患者，細(xì)胞數(shù)＞1×109。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th/Th2類(lèi)細(xì)胞功能

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD4細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ代表Th1類(lèi)細(xì)胞；CD4細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IL-4代表Th2類(lèi)細(xì)胞。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：用肝素鈉抗凝管采集靜脈血2 m L。取200μL全血標(biāo)本于試管中，用RPMl1640（不含小牛血清的FBS）1∶1等體積稀釋?zhuān)挥谠嚬苤屑尤?0μL（1μg/m L）PMA工作液+8μL（50μg/m L）lonomycin工作液+6.8μL（0.1 mg/m L）Monensin工作液，混勻；37℃，體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，混勻；取3試管，編號(hào)為A1，A2，A3，每管分別加入5μL CD3—PC5和10μL CD8—FITC及100 μL已培養(yǎng)的全血，劇烈混勻，室溫，避光孵育15 min；加入100μL Fix&Perm中的Reagent A（即固定液），劇烈混勻，室溫，避光孵育15 min；加入2 m L PBS，1500 r/min離心5 min，棄除上清；加入100μL Fix&Perm中的ReagentB（即破膜和溶血液），并吹打混勻（輕微），室溫下孵育5 min后，輕微搖晃混勻，各管中加入相應(yīng)的抗體各10μL（正常搖晃混勻）。A1、A2、A3管分別加抗體：MouseIgGI-Pe/IFN-γ-PE/ IL-4-PE，室溫，避光孵育15 min。每管中加入2 m L PBS，1500 r/min離心5 min，棄除上清，0.5 m L PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組內(nèi)治療前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

觀(guān)察組和對(duì)照組年齡、性別、HBV DNA含量、ALT水平在基線(xiàn)水平經(jīng)比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。15例CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物和10例單獨(dú)接受核苷（酸）類(lèi)藥物治療的患者在接受治療12周內(nèi)HBV DNA水平均達(dá)到檢測(cè)下限。

二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組間Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能的比較

從表1、表2觀(guān)察所見(jiàn)：各組間在治療前IFN-γ和IL-4水平無(wú)差異，觀(guān)察組和核苷（酸）類(lèi)藥物治療組在HBV DNA＜500拷貝/m L時(shí)間點(diǎn)經(jīng)比較IFN-γ和IL-4水平均無(wú)差異，并同CIK治療組患者比較在CIK治療后IFN-γ水平和IL-4水平也與前兩組無(wú)差異。觀(guān)察組接受CIK治療后與對(duì)照組比較，IFN-γ水平明顯高于CIK治療組和核苷（酸）類(lèi)藥物治療組，IL-4水平低于核苷（酸）類(lèi)藥物治療組和CIK治療組。同組間治療前后的比較可見(jiàn)：無(wú)論是觀(guān)察組還是核苷（酸）類(lèi)藥物治療組在接受核苷（酸）類(lèi)藥物治療HBV DNA＜500拷貝/m L時(shí)同基線(xiàn)水平比較IFN-γ升高而IL-4水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CIK治療組同治療前比較IFN-γ水平明顯升高，IL-4水平無(wú)差異。觀(guān)察組接受CIK治療后IFN-γ水平明顯升高并且IL-4水平降低。

表1 觀(guān)察組和對(duì)照組IFN-γ百分率比較（%，±s）

表1 觀(guān)察組和對(duì)照組IFN-γ百分率比較（%，±s）

注：#代表組內(nèi)治療前后比較，*代表觀(guān)察組和對(duì)照組比較，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

分組 例數(shù) 治療前 HBV DNA（-） CIK治療后 P值05核苷（酸）類(lèi) 10 1.656±0.869#2..511±1.133#2..511±1.133#*＜0.05藥物治療組CIK治療組 10 1.434±0.924#2.211±0.921#*＜0.05 t值 0.53 0.92 2.57 P值 0.56 0.37 ＜0.聯(lián)合治療組 15 1.511±1.026#2.139±0.826#3.288±0.561#*＜0.05

表2 觀(guān)察組和對(duì)照組IL-4百分率比較（%±s）

表2 觀(guān)察組和對(duì)照組IL-4百分率比較（%±s）

注：#代表組內(nèi)治療前后比較，*代表觀(guān)察組和對(duì)照組比較，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

分組 例 治療前 HBV DNA（-） CIK治療后 P值05核苷（酸）類(lèi) 10 0.571±0.209 0.477±0.255 0.477±0.255*0.43藥物治療組CIK治療組 10 0.485±0.219 0.428±0.208*0.52 t值 0.54 0.71 2.16 P值 0.55 0.47 ＜0.聯(lián)合治療組 15 0.47±0.119#0.577±0.219#0.277±0.237#*＜0.05

討 論

核苷（酸）類(lèi)藥物存在停藥后易復(fù)發(fā)并長(zhǎng)期服藥產(chǎn)生耐藥等局限性。如何維持持久的免疫應(yīng)答效應(yīng)提高e抗原血清轉(zhuǎn)換率并減少停藥后復(fù)發(fā)是臨床急待解決的問(wèn)題。已有大量研究證明，特異性CTL應(yīng)答減弱或缺失是乙型肝炎慢性化、病毒不易清除的主要機(jī)制，Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞失衡，Th2類(lèi)細(xì)胞功能優(yōu)勢(shì)表達(dá)是CTL細(xì)胞功能減弱的主要環(huán)節(jié)。因此，如何提高Th1類(lèi)細(xì)胞功能的優(yōu)勢(shì)表達(dá)，從而增強(qiáng)HBV特異性CTL功能是提高療效的主要策略之一［1］。CIK細(xì)胞是一種異質(zhì)細(xì)胞群體，主要功能細(xì)胞是CD3+CD56+T細(xì)胞，又稱(chēng)為NKT細(xì)胞。因?yàn)榇祟?lèi)細(xì)胞具有體外復(fù)制能力強(qiáng)、不受HLA-1抗原的限制、抗病毒治療效果優(yōu)等特點(diǎn)，目前已用于治療CHB并顯示出較明顯的療效和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［2-4］。早在2001年Boni等［5］已觀(guān)察到拉米夫定可改善CHB患者CTL低免疫應(yīng)答。后來(lái)Cooksley等［6］在阿德福韋酯治療CHB中也發(fā)現(xiàn)隨著病毒復(fù)制水平的降低，不但Th1類(lèi)細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平明顯增高，而且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）CD4+CD25+功能也下降。提示在核苷（酸）類(lèi)抗病毒治療過(guò)程中隨著病毒復(fù)制水平的抑制，Th1類(lèi)細(xì)胞功能恢復(fù)并優(yōu)勢(shì)表達(dá)。Akbar等［7］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在拉米夫定抗病毒治療過(guò)程中，DC細(xì)胞抗原遞呈能力明顯增強(qiáng)，可能是細(xì)胞免疫功能恢復(fù)的主要機(jī)制。國(guó)內(nèi)學(xué)者也觀(guān)察恩替卡韋、阿德福韋和替比夫定抗病毒治療過(guò)程中Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞功能動(dòng)態(tài)變化，提示在抗病毒治療過(guò)程中Th1類(lèi)細(xì)胞功能優(yōu)勢(shì)表達(dá)［8-9］。然而遺憾的是幾乎所有核苷（酸）類(lèi)藥物存在停藥后復(fù)發(fā)，特別是未發(fā)生e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者，停藥1年的復(fù)發(fā)率幾乎達(dá)100%。提示核苷（酸）類(lèi)藥物在抗病毒治療過(guò)程中可提高患者的免疫應(yīng)答能力，但只是部分的暫短的免疫功能增強(qiáng)，不能達(dá)到長(zhǎng)期維持抑制病毒復(fù)制的功能。Shi等［10］在CIK治療CHB過(guò)程中檢測(cè)了Th1類(lèi)細(xì)胞因子IFN-γ分泌并觀(guān)察了DC細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)完全應(yīng)答患者不但CIK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平明顯升高，并且DC細(xì)胞功能也明顯恢復(fù)。本研究通過(guò)對(duì)CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療的CHB患者觀(guān)察，并同CIK治療和核苷（酸）類(lèi)藥物治療比較，表現(xiàn)明顯的Th1類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)，同時(shí)有Th2類(lèi)細(xì)胞因子的降低，提示CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)藥物治療可明顯提高Th1類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)，并降低Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4的產(chǎn)生。但接受CIK治療僅有部分患者有一定的療效，提示誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效應(yīng)不夠完善。本研究觀(guān)察CIK聯(lián)合核苷（酸）類(lèi)似物治療CHB患者比單獨(dú)接受CIK治療或者核苷（酸）類(lèi)藥物治療更強(qiáng)的Th1類(lèi)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可能在提高CIK應(yīng)答效應(yīng)，維持長(zhǎng)時(shí)間的免疫應(yīng)答減少核苷（酸）類(lèi)藥物停藥復(fù)發(fā)會(huì)存在一定的優(yōu)勢(shì)效應(yīng)，當(dāng)然是否存在持久的免疫應(yīng)答效應(yīng)還需要長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀(guān)察，更需要嚴(yán)格的臨床觀(guān)察和驗(yàn)證。

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Dynamic changes of Th1/Th2 type cell function during the treatment of autologous cytokine-induced kill cells combined with nucleoside（acid）analogues in chronic hepatitis B patients

WANG Shao-yang，LIU Hai-zhou，MA Wei-min，WANG

Xian，XIE Li-ping，XIE Zhi-hong.Department of Infectious Diseases，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command，F(xiàn)uzhou 350003，China

WANG Shao-yang，Email：wsyang2005@163.com

ObjectiveTo investigate the metergasis of Th1/Th2 types cells in chronic hepatitis B（CHB）patients during the treatment of autologous cytokine-induced kill cells combined with nucleoside（acid）analogues therapy.MethodsFifteen CHB patients received CIK combined with nucleoside（acid）analogues were enrolled，while another 20 CHB patients only received CIK or nucleoside（acid）analogues were enrolled as control group.Detection of HBV DNA levels and liver functions were carried out during the treatment.The function of Th1/Th2 types cell were assessed by flow cytometry.ResultsThe level of interferon-γ（IFN-γ'，cytokines of Th1 type）was significantly increased after HBV DNA levels under the limit of detection during nucleoside（acid）analogues therapy，wnich was also observed in patients with CIK treatment.However，the level of interleukin-4（IL-4，cytokines of Th2 type）was not varied significantly.Compared with control group，the level of IFN-γwas significantly increased in treatment group of CIK combined with nucleosidec（acid）analogues at 2 weeks after treatment，however the level of IL-4 was significanthy decreased.ConclusionCIK combined with nucleoside（acid）analogues can increase the release of IFN-γ（cytokines of Th1 type），whereas inhibit IL-4（cytokines of Th2 type）levels，wnich may be related to the recovery of Th1/Th2 balance.

Hepatitis B；Cytokine-induced killer cells；Th1/Th2 type cell；Nucleoside（acid）analogues

2015-01-29）

（本文編輯：錢(qián)燕）

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011J01236）

350003福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院感染科，福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院傳染病學(xué)教研室

王少揚(yáng)，Email：wsyang2005@163.com