嚴鵬，趙淑敏

（承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河北 承德 067000）

大腦神經(jīng)元和血腦屏障（blood brain barrier， BBB）在缺血再灌注損傷后會發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，是缺血后病理生理變化的重要環(huán)節(jié)[1]。隨著對缺血再灌注損傷機制的深入研究，應用預處理方法防治缺血性腦卒中倍受關(guān)注，并成為近年來的研究熱點。丁苯酞（NBP）可通過調(diào)節(jié)腦缺血狀態(tài)下腦能量代謝、增加缺血區(qū)腦血流量、減少神經(jīng)細胞凋亡、改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀等[2-4]，在臨床治療方面取得了明顯的療效。但提前給藥以減輕隨后發(fā)生的缺血再灌注時組織損傷的作用機制和預防劑量尚不明確。實驗擬采用丁苯酞預處理大鼠，觀察腦缺血再灌注腦組織中神經(jīng)元及BBB的超微結(jié)構(gòu)變化，為將丁苯酞應用于臨床預防缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品

丁苯酞軟膠囊（NBP，批號118120711），石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司；伊文思藍（EB），TCI公司；OsO4，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Multiskan3 型酶標儀（Finland）； H-7650 透射電鏡（Hitachi，Japan）。

1.1.3 實驗動物分組與處理

清潔級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量260～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（京）2012-0001） 。適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為5組，假手術(shù)組、缺血再灌注組、NBP 20 mg/kg組、NBP 40 mg/kg組、NBP80 mg/kg組，每組6只。NBP各組于術(shù)前1周分別灌胃給予NBP 20 mg/（kg·d）、40 mg/（kg·d）、80 mg/（kg·d）預處理，連用7 d；假手術(shù)組和缺血再灌注組給等容積生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型制備

10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，缺血再灌注組和NBP各劑量組參照Longa[5]改良線栓法，制作大鼠局灶性大腦中動脈缺血再灌注模型（MCAO），缺血2 h再灌注24 h。假手術(shù)組不插入栓線。大鼠麻醉清醒后，參照Longa 5分制評分標準進行神經(jīng)行為學評分。0分，正常，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪，輕度神經(jīng)功能缺損；2分，行走時，大鼠向左側(cè)（癱瘓側(cè)） 轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時，大鼠身體向左側(cè)（癱瘓側(cè)） 傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分越高，說明神經(jīng)損傷障礙越嚴重。實驗過程中死亡者剔除并補足。

1.2.2 BBB通透性測定

再灌注23 h后，經(jīng)鼠尾靜脈注入2% EB（4 mL/kg），大鼠球結(jié)膜、皮膚變藍示注入成功。循環(huán)1 h后，經(jīng)心灌注預冷（4 ℃）生理鹽水，當右心房流出清亮液體時，迅速斷頭取腦。取缺血側(cè)腦組織，稱濕質(zhì)量。浸泡于5 mL甲酰胺溶液中，恒溫培養(yǎng)箱（54 ℃）孵育24 h，離心5 min，1000 r/min，吸取上清液200 μL用酶標儀測定其630 nm處的OD值。甲酰胺溶液做空白比色。腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量（μg/g）=待測樣品EB含量（μg/mL）×甲酰胺容量（mL）/腦濕質(zhì)量（g），待測樣品EB含量根據(jù)標準曲線求得。

1.2.3 電鏡樣品制作

大鼠麻醉后，經(jīng)心臟灌注2%戊二醛和4%多聚甲醛混合液固定。取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，常規(guī)電鏡樣品包埋，半薄切片選區(qū)，超薄切片，鈾、鉛雙重染色，H-7650透射電鏡觀察并采集圖片。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為0；缺血再灌注組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯增高；與缺血再灌注組相比較，NBP各組評分顯著降低（P<0.05）， NBP 40 mg/kg組與NBP 80 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 各組EB含量測定

與假手術(shù)組相比較，缺血再灌注組腦組織EB含量顯著增高，說明BBB通透性增高，完整性破壞。NBP各劑量組較缺血再灌注組EB含量明顯降低（P<0.01，P<0.05），NBP 20 mg/kg組即可減輕腦缺血再灌注誘導的BBB破壞；NBP 40 mg/kg組、NBP 80 mg/kg組較NBP 20 mg/kg組抑制BBB的通透性作用更明顯（P<0.05），NBP 40 mg/kg組、NBP 40 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分和EB含量的變化（，n=6）

表1 各組腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分和EB含量的變化（，n=6）

與缺血再灌注組比較，aP<0.01，bP<0.05；與 NBP 20 mg/kg 組相比，cP<0.05。

組別 神經(jīng)功能缺損評分 EB/（μg/g）假手術(shù)組 0a 3.25±0.56a缺血再灌注組 2.90±0.92 12.03±2.41 NBP 20 mg/kg 組 1.81±1.10b 10.11±2.36b NBP 40 mg/kg 組 1.56±0.76ac 7.29±2.05ac NBP 80 mg/kg 組 1.51±0.84ac 6.59±1.51ac F 9.657 18.841 P 0.000 0.000

2.3 缺血區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元及BBB超微病理變化

透射電鏡下觀察，假手術(shù)組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞膜、核膜較清晰，染色質(zhì)分布均勻；線粒體、核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，可見高爾基體、溶酶體（圖1a）；BBB內(nèi)皮細胞、基膜連續(xù)完整，膠質(zhì)細胞足板構(gòu)成的膠質(zhì)膜排列緊密，胞質(zhì)飽滿（圖2a）。缺血再灌注組腦缺血區(qū)神經(jīng)元溶解、壞死，細胞膜、核膜模糊或斷裂，染色質(zhì)凝集；胞質(zhì)溶解，各種細胞器結(jié)構(gòu)均不清，出現(xiàn)大小不等的空泡（圖1b）。BBB的血管內(nèi)皮腫脹、染色深，基膜劈裂、溶解，膠質(zhì)膜胞質(zhì)溶解呈大片空泡（圖2b）。NBP 20 mg/kg 組缺血區(qū)神經(jīng)元腫脹略減輕，核膜較完整但不清晰，核仁趨向中央，線粒體損傷減輕，但仍有空泡化線粒體，高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張（圖1c）；BBB內(nèi)皮細胞腫脹減輕，基膜連續(xù)，膠質(zhì)膜胞質(zhì)溶解好轉(zhuǎn)，可見線粒體等細胞器，但部分足板仍空化，呈大小不等、不規(guī)則的囊泡狀（圖2c）。NBP 40 mg/kg 組核膜清晰、完整，核仁較大仍偏位，染色質(zhì)較均勻；線粒體大部分較完整，也有部分嵴減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體較豐富（圖1d）；BBB內(nèi)皮細胞腫脹明顯減輕，基膜連續(xù)，膠質(zhì)膜大部分足板胞質(zhì)溶解已少見，細胞器增多（圖2d）。NBP 80 mg/kg組膜結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，染色質(zhì)較均勻；線粒體趨于正常，可見高爾基復合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，較豐富的核糖體（圖1e）；BBB內(nèi)皮細胞完整、無水腫，可見細胞器，基膜均勻、連續(xù)，膠質(zhì)膜足板胞質(zhì)溶解少見，細胞器較多（圖2e）。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化（×15000）

圖2 各組大鼠BBB超微結(jié)構(gòu)的變化（×15000）

3 討論

腦缺血再灌注損傷最顯著的組織學變化是神經(jīng)元丟失和BBB結(jié)構(gòu)破壞導致的血管源性腦水腫，而細胞和組織的超微結(jié)構(gòu)是反映細胞損傷和修復最為直觀的指標。本實驗結(jié)果顯示，缺血再灌注組神經(jīng)元和BBB嚴重受損，如神經(jīng)元崩解、壞死，染色質(zhì)凝集，膜結(jié)構(gòu)斷裂不完整，胞質(zhì)溶解，僅見少量嚴重受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體；BBB的毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、壞死，基膜斷裂、溶解，膠質(zhì)膜足板胞質(zhì)溶解呈大空泡狀，僅存少量溶解、破壞的細胞器碎片。與Zhao等[6]研究結(jié)果一致。EB含量檢測發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后，大鼠腦組織中EB含量比假手術(shù)組顯著增高，也表明BBB通透性增高、完整性破壞。

NBP是從芹菜籽中提取的有效成分，藥物作用廣泛，有改善微循環(huán)、抑制興奮性氨基酸釋放、增強抗氧化酶活性、降低Ca2+超載、保護線粒體、減少神經(jīng)元凋亡等作用[7-9]。本實驗結(jié)果顯示，NBP預處理各組缺血區(qū)神經(jīng)元腫脹減輕，膜結(jié)構(gòu)漸完整、清晰，線粒體損傷明顯減輕，高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細胞器數(shù)量和形態(tài)趨于正常；BBB內(nèi)皮細胞腫脹、膠質(zhì)膜胞質(zhì)溶解漸好轉(zhuǎn)，足板空化減輕，細胞器增多，基膜漸連續(xù)。從形態(tài)學方面上證實了以往研究結(jié)果[10-12]，說明NBP干預可減輕隨后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷，對神經(jīng)元具有預防性保護作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，NBP 20 mg/kg組即可明顯減輕腦缺血再灌注所致的神經(jīng)元和BBB破壞；NBP 40 mg/kg組、NBP 80 mg/kg組較NBP 20 mg/kg組作用更明顯，NBP 40 mg/kg組與NBP 80 mg/kg 組之間差異不明顯（P>0.05）。說明NBP預處理對腦缺血再灌注神經(jīng)元和BBB損傷有明顯的預防性保護作用，NBP 40 mg/kg組預防效果較好。因此，為NBP開發(fā)成腦卒中高危人群預防用藥及劑量提供了重要的實驗依據(jù)。

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