李安玉, 佘文琴

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

橄欖果實(shí)總RNA提取方法的比較

李安玉, 佘文琴

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

針對(duì)橄欖果實(shí)富含酚類、多糖、蛋白質(zhì)等次生代謝物的特點(diǎn)，采用百泰克總RNA抽提試劑盒法、Trizol法和CTAB法提取橄欖果實(shí)總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性。結(jié)果表明，CTAB法提取的RNA純度高，完整性較好，受多糖多酚影響較少，且無(wú)DNA和蛋白質(zhì)污染，適宜用于后續(xù)研究。

橄欖果實(shí); 總RNA; CTAB法；Trizol法；瓊脂糖凝膠電泳

橄欖(CanariumalbumL.)屬橄欖科(Burseraceae)橄欖屬(Canarium)，是我國(guó)南方的特色果種，主要有滇欖、方欖、白欖、烏欖、小葉欖、越欖，產(chǎn)地包括廣東、海南、福建、臺(tái)灣及云南等，多見(jiàn)于常綠闊葉林及其次生林中，栽培種主要有白欖和烏欖[1]。橄欖鮮果不僅富含碳水化合物、Ca、Vc等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，還具有開胃下氣，解酒護(hù)肝等藥用價(jià)值[3]，其藥食兩用的保健功能，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。

提取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行Northern-Blot分析、RT-PCR以及構(gòu)建cDNA文庫(kù)等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。由于酚類和蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)以及核糖核酸酶的廣泛存在，往往很難獲得純度高、完整性好的橄欖果實(shí)RNA，即使微量核糖核酸酶都會(huì)使提取的RNA降解；多糖是影響RNA提取的另一個(gè)重要因素，多糖在水中的理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過(guò)程中往往會(huì)與RNA形成難溶的膠狀物共同沉淀下來(lái)[4]，傳統(tǒng)的提取方法難以將它們分離，而且在除去多糖的同時(shí)，RNA也會(huì)被部分除去，造成RNA產(chǎn)量的降低[5-6]。本研究采用百泰克總RNA抽提試劑盒法、Trizol法和CTAB法等3種方法提取橄欖果實(shí)總RNA，并對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行比較分析，探索最佳的提取方法，以期為相似物種RNA的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的橄欖果實(shí)采自福州綠百合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司種植基地。采回的橄欖鮮果用清水沖洗后擦干，切碎果肉，液氮速凍，分裝，冷藏于-80 ℃冰箱，備用。

試驗(yàn)試劑包括百泰克多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(RP3301)、Trizol試劑、十六烷三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)等；氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、LiCl、β-巰基乙醇等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)儀器包括凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)、臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)、恒溫水浴鍋、電泳儀(北京六一儀器廠)、TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)等。試驗(yàn)所需塑料制品均用0.1%DEPC水37 ℃處理12 h以上，高溫高壓滅菌，65 ℃烘干。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百泰克試劑盒法 依照北京百泰克公司多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒(RP3301)說(shuō)明書步驟進(jìn)行，以 30 μL 無(wú)RNA酶水溶解沉淀，取3 μL檢測(cè)，其余-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Trizol法 取0.1 g橄欖果肉直接放入研缽中，加入少量液氮迅速研磨，轉(zhuǎn)入離心管中并加入1 mL Trizol試劑，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，將勻漿樣品在室溫下放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離，4 ℃，10 000 r·min-1離心10 min，取上清。上清液中加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，離心15 min，把上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min，離心10 min，移去上清，加入1mL 75%乙醇洗滌2次，4 ℃，7 500 r·min-1離心5 min，棄上清，室溫放置15 min，晾干，加入30 μL 無(wú)RNA酶水，用槍頭吸打幾次，溶解沉淀，取3 μL檢測(cè)，其余-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CTAB法 CTAB提取液的配制：0.02 g·mL-1CTAB，0.02 g·mL-1PVP，100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol·L-1EDTA，2.0 mol·L-1NaCl，0.02 g·mL-1β-巰基乙醇(使用前加入)。在1.5 mL離心管中加入1 mL CTAB提取液和20 μL β-巰基乙醇，于65 ℃預(yù)熱。稱取0.1 g橄欖果實(shí)于液氮中迅速研磨成粉末，將樣品移至預(yù)熱好的裝有CTBA提取緩沖液離心管中，渦旋混勻30 s，65 ℃溫浴20 min，期間保持振蕩1-2次，然后每管加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，渦旋混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min。取上清移至新離心管，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，再次離心。取上清移至新離心管，加入等體積8 mol·L-1LiCl，-20 ℃下沉淀2 h后離心10 min，棄上清，加入500 μL無(wú)水乙醇，再離心10 min，棄上清，加入500 μL 75%乙醇清洗管底沉淀，倒掉75%乙醇，吸干離心管中殘留的液體，RNA沉淀在超凈臺(tái)上干燥15 min，用30 μL無(wú)RNA酶水溶解沉淀，取3 μL檢測(cè)，其余-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠電泳檢測(cè)

凝膠電泳是檢測(cè)RNA質(zhì)量的一種重要手段，從電泳膠上不僅可以判斷RNA的完整性和降解程度，也可以判斷有無(wú)DNA、蛋白質(zhì)和多糖污染。本試驗(yàn)所得RNA的凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，百泰克試劑盒法可以看到清晰的28S、18S和5S 3條條帶，雖然28S與18S亮度比值接近2∶1，條帶之間有彌散現(xiàn)象，但是出現(xiàn)5S條帶說(shuō)明RNA有所降解，所提取的RNA完整性不是很好。CTAB法可以看到28S和18S完整的2條條帶，且28S與18S亮度比值接近2∶1，條帶之間無(wú)彌散現(xiàn)象，加樣孔內(nèi)干凈，表明沒(méi)有蛋白質(zhì)和多糖等其他物質(zhì)污染，因此，采用此法提取的RNA完整性較好。Trizol法可看到2條微弱的28S、18S條帶，條帶之間有彌散現(xiàn)象，表明RNA嚴(yán)重降解，點(diǎn)樣口也能見(jiàn)到微弱的熒光，表明有多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染，提取效果較差。綜上所述，CTAB法提取的RNA條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整，此方法最適宜用于橄欖果實(shí)總RNA的提取。

A.百泰克試劑盒法;B.CTAB法;C.Trizol法。

2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)

純凈RNA樣品的D260 nm/D280 nm介于1.7-2.0之間，D260 nm/D230 nm在2.0-2.2之間[7-10]。將3種方法所提取RNA的純度和濃度經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，CTAB法提取的RNAD260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm均在此范圍內(nèi)，說(shuō)明樣品中RNA不含多糖等雜質(zhì)，且RNA濃度最高，表明RNA純度好；百泰克試劑盒法的比值稍微偏離此范圍，其RNA濃度也較CTAB法低，提取效果一般；Trizol法的比值不在此范圍內(nèi)，說(shuō)明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類等其他有機(jī)物的污染，且濃度最低，不適合用于后續(xù)試驗(yàn)。綜上所述，利用CTAB法提取的橄欖果實(shí)總RNA純度高，完整性好，最適合用于后續(xù)研究。

表1 3種方法提取橄欖果實(shí)總RNA的純度和濃度

3 結(jié)論與討論

在進(jìn)行以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)試驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)植物材料的不同，選擇適合的RNA提取方法[11]。由于核糖核酸酶的廣泛存在，加之橄欖組織中富含酚類、多糖和蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)，給橄欖果實(shí)RNA提取帶來(lái)了一定的困難[12]。本研究表明，CTAB法提取的RNA純度高，完整性較好。百泰克試劑盒法與Trizol法提取的RNA或有多糖、多酚和蛋白質(zhì)等次生代謝物質(zhì)的污染，或者嚴(yán)重降解。因此，能否有效去除這些雜質(zhì)，且避免核糖核酸酶的降解是提取橄欖果實(shí)RNA的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)中CTAB法同時(shí)使用了PVP和β-巰基乙醇，可有效防止多酚物質(zhì)與RNA的結(jié)合，抑制多酚的氧化和核糖核酸酶活性，提高RNA產(chǎn)量[13]；提取緩沖液中提高了NaCl的濃度，能夠有效去除多糖雜質(zhì)[14]；利用LiCl選擇性沉淀RNA，去除了DNA的污染[15]；再經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇和75%乙醇的洗滌，極大地除去了多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，得到純度較高的RNA，滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

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(責(zé)任編輯:張?jiān)蒲?

Comparison of total RNA extraction methods of olive fruits

LI An-yu, SHE Wen-qin

(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Features of olive fruits are rich in polyphenols, polysaccharides, proteins and other secondary metabolites, BioTeke total RNA extraction kit, Trizol and CTAB methods were used for total RNA extraction of olive fruits, the ultraviolet spectrophotometer was used to measure the purity, and the agarose gel electrophoresis was used to test the integrity. The results showed that, the RNA extracted by CTAB method performed high purity and better integrity which less affected by the polysaccharide polyphenols, as well as no contamination of DNA and proteins, thus could be used for future research.

olive fruits; total RNA; CTAB method; Trizol; agarose gel electrophoresis

2015-06-30

福建省科技重大專項(xiàng)(2013NZ0002-1C)。

李安玉(1991-)，男，碩士研究生。研究方向：果樹生物技術(shù)。Email：15880491259@163.com。通訊作者佘文琴(1970-)，女，教授，博士。研究方向：園藝植物生理生化與分子生物學(xué)。Email：Wenqinshe@163.com。

S667.5；Q522

A

1673-0925(2015)03-0198-04

10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2015.03.012