劉德賢 陶遵威 張 婷 張 巖

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300073；2.天津醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020

咳喘顆粒為院內(nèi)制劑，由五味子、白芍、甘草、黃芩等14味中藥組成，具有解表散寒、溫肺化飲之功效，治療咳嗽、哮喘效果顯著，未見相關(guān)的指紋圖譜報道。中藥復(fù)方作用特點相輔相成，即多成分、多系統(tǒng)、多靶點的綜合效應(yīng)[1-3]，因此用單一指標(biāo)成分往往不能達到全面評價和控制復(fù)方制劑質(zhì)量的效果，而指紋圖譜由于其具有多指標(biāo)全面分析的作用[4-5]，已成為評價中藥質(zhì)量的有效方法，并被廣泛用于中藥及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究[6-10]。因此，為了更好地控制咳喘顆粒質(zhì)量，為臨床用藥提供依據(jù)，本實驗采用HPLC方法[11-12]建立咳喘顆粒的化學(xué)指紋圖譜，著重表達藥材的信息。對咳喘顆粒指紋圖譜中主要指紋峰進行歸屬，實現(xiàn)系統(tǒng)、多角度控制咳喘顆粒質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT日本島津公司），PDA檢測器；超聲儀（KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（ABS135-S，瑞士梅特勒-托利多公司）；電子天平（JJ200，常熟雙杰測試儀器廠 ）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：1110736-200934，由中國食品藥品檢定研究院提供）、甘草苷對照品（批號：11610-201106）、黃芩苷對照品（批號 110715-201117）、甘草酸銨對照品 （110731-200615）、五味子醇甲對照品（110857-201211），以上五種對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供）；乙腈（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司），甲醇（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈宏振飲料有限公司），咳喘顆粒 （批號：tl20140507001～tl20140507010，醫(yī)內(nèi)制劑）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相 A 為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～50%A；50～90 min，50%～90%A；90～100 min，90%～100%A；檢測波長237 nm，流速1.0 ml/min，分析時間75 min，進樣量 10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.1、0.04、0.085、0.18 mg/ml的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取咳喘顆粒約5.0 g，置50 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，回流提取60 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別取供試品（tl20140507001）和對照品溶液進樣，記錄237 nm波長下色譜圖。對保留時間和紫外光譜圖進行對比可知 6、7、10、15、16 號峰分別是芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨、五味子醇甲。10號峰（黃芩苷）10批供試品均有，峰型好，峰位適中，與相鄰峰分離良好。因此作為參照物峰，如圖1、圖2。在此條件下，理論塔板數(shù)以黃芩苷計算＞2500。

圖1 批號（tl20140507001）樣品HPLC色譜圖

圖2 對照品HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密取樣品（tl20140507001）溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項色譜條件測定，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.51%，相對峰面積的RSD為1.24%～2.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密取樣品（tl20140507001）溶液，分別于 0、4、8、16、24、48 h，按“2.1”項下色譜條件測定，以10號峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.46%，相對峰面積的RSD為0.78%～2.12%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取樣品（tl20140507001）溶液，精密稱取5份，按照“2.3”下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以10號峰（黃芩苷）為參照峰，考察各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的一致性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.37%，相對峰面積的RSD為1.05%～2.47%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 標(biāo)定共有峰

對10批咳喘顆粒進行檢測，記錄色譜圖，以共有率100%記，共有16個共有峰，10批咳喘顆粒HPLC圖譜各共有峰相對保留時間除11號 （1.5189）、13號（1.7136）、14 號（2.6392），其余均<1.0，符合指紋圖譜要求，結(jié)果見表1、表2。

2.7 建立指紋圖譜共有模式

將10批咳喘顆粒HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版），以S5為參照，采用中位數(shù)法生成對照圖譜和共有模式圖譜，如圖3。

圖3 10批咳喘顆粒樣品HPLC色譜圖

表1 10批樣品的共有峰的峰面積

表2 10批樣品指紋圖譜相對保留時間

2.8 指紋圖譜相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版）對上述10批咳喘顆粒樣品進行特征圖譜相似度計算，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，10批咳喘顆粒相似度評價結(jié)果均＞0.96，直觀說明各批次咳喘顆粒之間無明顯差異性，本方法可用于鑒別咳喘顆粒的整體質(zhì)量。

表3 10批樣品指紋圖譜相似度計算結(jié)果

3 討論

3.1 指紋圖譜檢測波長的確定

考察了咳喘顆粒主要成分，參照相關(guān)文獻[13-21]，分別對 210、237、250、294 nm 進行篩選。 210、290 nm 出峰較少，且出峰時間較晚。250 nm出峰較多，但是基線漂移。237 nm時出峰多、分離度好、基線平，因此選237 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實驗首先對等度洗脫與梯度洗脫進行選擇，結(jié)果等度洗脫分離度不如梯度洗脫好，因此選擇梯度洗脫。其次，對甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水四種流動相進行選擇，結(jié)果甲醇-磷酸、乙腈-磷酸峰型較甲醇-水、乙腈-水好，且基線平，乙腈-磷酸較甲醇-磷酸出峰多。因此，流動相選擇乙腈-磷酸梯度洗脫。

3.3 提取條件的選擇

本實驗首先對不同提取方法（超聲提取方法和加熱回流提取方法）進行選擇，結(jié)果回流提取較超聲提取出峰多且峰型好，因此選擇回流提取。其次對提取溶劑進行選擇，樣品分別加50 ml 25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、純甲醇、純乙醇溶液加熱回流提取，結(jié)果50%甲醇提取出峰最完全，分離度最好，所以選擇50%甲醇提取。最后考察提取時間，分別用 50%甲醇回流提取 15、30、45、60 min，結(jié)果超聲30 min，樣品出峰最完全，所以選擇30 min。因此，最終提取條件為50%甲醇回流提取30 min。

3.4 參照峰的確定

通過比較對照發(fā)現(xiàn)，6號峰是芍藥苷對照品峰，為咳喘顆粒白芍的主成分峰，峰面積大，但由于有拖尾現(xiàn)象；7號基線不平且分離度不好；15、16號峰峰型較??；因此6、7、15、16均不宜作參照峰；而10號峰峰面積較大，出峰時間較穩(wěn)定，基線較平，因此選作參照峰。

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