賈 暖，董玉波

環(huán)孢素A（CsA）自1972年發(fā)現(xiàn)以來，被廣泛地應(yīng)用于器官移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)。由于CsA服用后個體差異大，患者術(shù)后需長期服用，治療窗范圍窄，低于有效濃度易引起排斥反應(yīng)或誘發(fā)自身免疫性疾病，高于有效濃度則易引起感染或肝／腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，所以有必要對用藥患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，CsA全血的濃度測定已經(jīng)成為臨床醫(yī)師監(jiān)測或調(diào)整給藥劑量的依據(jù)和常規(guī)。但是影響CsA血藥濃度結(jié)果的因素有很多[1]，其中檢測方法的不同，也會影響到臨床醫(yī)師對監(jiān)測結(jié)果評判，以致影響用藥方案的調(diào)整。目前，臨床對CsA的檢測方法多為熒光免疫偏振法（FPIA），因其具備自動化程度高，樣品需求量少、重現(xiàn)性好、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，但此測定方法存在代謝物交叉反應(yīng)，為了減少交叉反應(yīng)對最終結(jié)果的影響，檢測方法從FPIA發(fā)展到化學(xué)發(fā)光微粒子分析法 （CMIA）。本文對 FPIA的 AxSYM與 CMIA的Architect I1000中測定結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行研究，為臨床合理應(yīng)用環(huán)孢素A提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光偏振免疫儀AxSYM （美國雅培公司）；化學(xué)發(fā)光微粒子分析儀Architect I1000（美國雅培公司）；Heraeus臺式離心機(jī)（德國 Heraeus）；XW－80A 旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。試劑為Architect環(huán)孢霉素全血試劑盒、單克隆抗體全血環(huán)孢霉素試劑盒，及兩種儀器原配質(zhì)量控制試劑盒、校準(zhǔn)曲線試劑盒，以上試劑均為美國雅培（Abbott）制藥有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 腎移植術(shù)后2周至12年患者124例。男95例，女29例；年齡19～64歲，平均38.9歲。服用環(huán)孢素A作為免疫抑制藥，于下次服藥前30 min抽取空腹靜脈血2～3ml，EDTA抗凝后進(jìn)行全血CsA谷濃度檢測。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室條件及血藥濃度測定 CsA全血濃度測定在室溫25℃標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，每一例患者樣本在同一天分別用AxSYM和Architect I1000兩臺儀器測定，測定方法按照美國Abbott公司提供的AxSYM全自動免疫生化分析儀和Architect I1000分析儀操作手冊操作。①熒光偏振免疫法：樣本取全血 150μl置1.5m l離心管中，加入 AxSYM標(biāo)配50μl細(xì)胞溶解劑和300μl蛋白沉淀劑，渦旋混勻30 s，10000 r／min離心5min，取上清進(jìn)行檢測。②化學(xué)發(fā)光微粒子法：樣本取全血200μl置1.5ml離心管中，加入 Architect I1000標(biāo)配100μl細(xì)胞溶解劑和400μl蛋白沉淀劑，渦旋混勻30 s，10000 r／min離心4min，取上清液進(jìn)行檢測。

1.2.3 校準(zhǔn)曲線及最低檢測濃度 AxSYM標(biāo)配校準(zhǔn)曲線試劑盒濃度分別為 0、40、100、200、400、800 ng／ml CsA 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2項(xiàng)下操作進(jìn)行校準(zhǔn)，最低檢測濃度為23.2 ng／m l；取Architect I1000標(biāo)配校準(zhǔn)曲線試劑盒濃度分別為0、40、150、400、800、1500 ng／mlCsA 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按 2.2 項(xiàng)下操作進(jìn)行校準(zhǔn)，最低檢測濃度為 25.0 ng／ml。

1.2.4 質(zhì)量控制 AxSYM 標(biāo)配低、中、高（70、300、600 ng／m l）3種不同濃度質(zhì)量控制 （QC）樣品，按2.2項(xiàng)下操作；Architect I1000 標(biāo)配低、中、高（81.3、150、761 ng／ml）3 種不同濃度質(zhì)量控制（QC）樣品，按1.2.2項(xiàng)下操作。兩種儀器分別于同一天內(nèi)分別處理并測定5份，評價日內(nèi)精密度；同一樣品連續(xù)測定5 d，每天測定一份，評價日間精密度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)及結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對兩種方法的檢測結(jié)果間進(jìn)行相關(guān)分析，以r表示。兩種方法結(jié)果的比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05則認(rèn)為結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控樣品的分析測定 質(zhì)控樣品的分析測定結(jié)果見表1。

表 1 兩種方法的 QC及 CV 結(jié)果（ng／m l，n＝5）

2.2 相關(guān)性分析 經(jīng)兩種儀器對124例患者CsA全血樣本進(jìn)行測試，將測試樣品以CMIA法測定結(jié)果（X）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)PIA法測定結(jié)果（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝1.241x＋8.8438，r＝0.9502（n＝124），曲線見圖 1。 CMIA 法測定濃度范圍 24.1～554.0 ng／m l，F(xiàn)PIA 法測定濃度范圍 57.7～769.1 ng／ml，CMIA 法比 FPIA 法平均偏差低 35.69 ng／ml。 將兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，P＜0.05提示結(jié)果具有顯著性差異。

圖 1 兩種方法相關(guān)性分析

3 討 論

目前臨床上對CsA的測定HPLC和FPIA法較為成熟，而且兩種方法對檢測結(jié)果的比較也多受關(guān)注[2]，由于HPLC測定周期長，批量檢測時，F(xiàn)PIA法在臨床應(yīng)用中已成為測定的首選方法[3]。但是這種技術(shù)也存在一定的局限性，被測藥物的多種內(nèi)源性代謝物因?yàn)榕c其具有非常相似結(jié)構(gòu)，易發(fā)生交叉反應(yīng)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。CMIA與FPIA測定原理不同：FPIA法是根據(jù)抗原、抗體競爭結(jié)合法的原理，即利用被測物質(zhì)中被測對象所有的偏振光性進(jìn)行熒光免疫分析。CMIA采用兩步雙抗原夾心法，以順磁性微珠包被CsA抗體后，與標(biāo)本中的CsA抗原結(jié)合，加入吖啶酯標(biāo)記的CsA抗原后，在特定的磁場區(qū)發(fā)生沉積，經(jīng)反復(fù)洗滌使游離抗原或抗體與抗原抗體復(fù)合物分離，測定其激發(fā)光強(qiáng)度的方法。受測定原理的影響，同一份樣品的結(jié)果也產(chǎn)生了偏倚，本試驗(yàn)研究中同一CsA全血樣品分別采用兩種方法測定，ARCHITECT測定結(jié)果較AxSYM測定結(jié)果低，平均濃度低35.69 ng／m l，也有文獻(xiàn)報(bào)道 ARCHITECT 測定結(jié)果較 AxSYM平均濃度低 42.6 ng／ml[4]、76.5 ng／ml[5]，可能與所測樣品的濃度范圍以及樣本量、群體樣本的來源等因素有關(guān)。CsA口服吸收后，經(jīng)CYP3A4代謝后產(chǎn)生30多種代謝產(chǎn)物（AM1、AM9、AM1c、AM4n、AM19 等）[6]， 而在達(dá)穩(wěn)態(tài)后 AM1 能夠占母藥的40%[7]，CMIA法能夠減少代謝產(chǎn)物的交叉反應(yīng)，尤其減少與AM1、AM9的交叉反應(yīng)[8]，說明CMIA法相比FPIA法特異性較高，兩組數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CMIA法的測定值更能夠反應(yīng)母藥在體內(nèi)的濃度，結(jié)果更準(zhǔn)確。兩方法相關(guān)系數(shù)為0.9502，表明兩測量結(jié)果具有高度相關(guān)，與文獻(xiàn)[9，10]報(bào)道一致。 另 CMIA 法的線性范圍 0～1500 ng／m l，而FPIA法的線性范圍0～800 ng／m l，若在臨床上需要監(jiān)測服藥后 2 h的血藥濃度 （C2） 或待測標(biāo)本濃度超過 800 ng／m l，CMIA方法可以減少需要稀釋而帶來的誤差。

CMIA法比FPIA法特異性和靈敏度高，CMIA法優(yōu)于FPIA法?；颊咴谶M(jìn)行環(huán)孢素血藥濃度檢測時，盡量選擇同一醫(yī)院同一種儀器進(jìn)行測定，檢測報(bào)告最好注明檢測方法，以方便臨床醫(yī)師結(jié)合患者的個體情況給出準(zhǔn)確的藥物調(diào)整方案。

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