陳旖旎，白文坤，胡兵

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低頻低能量超聲聯(lián)合微泡對前列腺細(xì)胞的影響

陳旖旎，白文坤，胡兵

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海超聲醫(yī)學(xué)研究所，上海 200233)

目的：采用原子力聲顯微鏡及透射電鏡觀察低頻低能量超聲聯(lián)合微泡對前列腺癌細(xì)胞DU145及正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1的作用。方法：兩種細(xì)胞均分為對照組、單純超聲組、超聲聯(lián)合微泡組。對照組加入一定比例的生理鹽水，不進行超聲輻照；單純超聲組加入相同比例的生理鹽水，用發(fā)射頻率為21 kHz的低頻超聲輻照，輻照2 min，占空比30%；超聲聯(lián)合微泡組加入同前相同比例的微泡造影劑懸濁液，用與單純超聲組相同的超聲輻照。處理過的細(xì)胞立即用原子力聲顯微鏡觀察其形貌并計算其楊氏模量。同時，對同一處理方式的對照組及超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用透射電鏡觀察細(xì)胞。結(jié)果：單純超聲組的DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)與對照組無明顯變化；超聲聯(lián)合微泡組的DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞形態(tài)呈類圓形，細(xì)胞表面可見放射狀顯微絲狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜表面可見多個大孔狀結(jié)構(gòu)；超聲聯(lián)合微泡組的DU145細(xì)胞的彈性模量較RWPE-1細(xì)胞大，且與對照組相比，兩種細(xì)胞的彈性模量均變大，DU145細(xì)胞尤甚。透射電鏡觀察結(jié)果示對照組的兩種細(xì)胞未見細(xì)胞自噬，而超聲聯(lián)合微泡組兩種細(xì)胞都出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，其中DU145細(xì)胞中可見凋亡現(xiàn)象。結(jié)論：低頻低能量超聲聯(lián)合微泡可引起前列腺癌DU145細(xì)胞及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)其自噬，且對DU145細(xì)胞的損傷大于RWPE-1細(xì)胞。

低頻低能量超聲；微泡造影劑；前列腺癌；原子力聲顯微鏡；細(xì)胞自噬

0 引言

近年來，低頻超聲被廣泛應(yīng)用于疾病治療中。

許多學(xué)者研究了低頻、低能量超聲聯(lián)合微泡對腫瘤的作用[1-3]后發(fā)現(xiàn)，低頻、低能量超聲聯(lián)合微泡可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的自噬及凋亡。

前列腺癌是發(fā)病率較高的男性惡性腫瘤。在美國，占男性癌癥死因的第二位[4]。大多數(shù)患者經(jīng)治療后由激素敏感性變?yōu)榧に氐挚剐?，成為激素非依賴性或難治性前列腺癌[5]。本實驗擬用原子力聲顯微鏡及電鏡觀察低頻低能量超聲聯(lián)合微泡對激素非依賴性人前列腺癌細(xì)胞系DU145及正常永生化的前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺癌細(xì)胞株DU145(科院細(xì)胞庫)及前列腺正常上皮細(xì)胞系RWPE-1(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；超聲波治療儀由超聲波發(fā)生器、單路功放及圓形平面換能器組成，輸出功率可調(diào)，本實驗發(fā)射頻率為21 kHz，直徑為13 mm；Veeco DI 3100型原子力顯微鏡，探針型號1：SICON-200，彈性常數(shù)為0.02~0.8 N／m，諧振頻率為5~25 kHz；探針型號2：ACT-200，彈性常數(shù)為25~75 N／m，諧振頻率為200~400 kHz；壓電片；HiRox (KH-7700)數(shù)字體式顯微鏡；微泡使用Bracco公司聲諾維，為SF6微泡，直徑為2~8 μm，使用前生理鹽水5 ml稀釋振蕩；其他試劑及儀器：角化細(xì)胞-SFM，重組上皮生長因子1-53 (EGF 1-53)，牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extract, BPE)(Gibco，美國)；1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；0.25％胰酶(Gibco，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞樣本制備方法

DU145細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天傳代一次；RWPE-1細(xì)胞培養(yǎng)在K-SFM(500 ml內(nèi)含有25 mg BPEJ及2.5 μg EGF)中，37 °C、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天傳代一次；以蓋玻片為細(xì)胞黏附底物，玻片邊長21 mm，透明白色，硼硅玻璃。蓋玻片在乙醇中浸泡15 min后，取用無菌PBS溶液稀釋過的濃度為100 μg/ml多聚賴氨酸0.25 ml，滴在準(zhǔn)備好的無菌蓋玻片上4 °C過夜，使多聚賴氨酸黏附在蓋玻片上。第二天吸去多余的多聚賴氨酸溶液，把蓋玻片用無菌蒸餾水浸洗兩次。空氣干燥并紫外線照射15 min后使用。將蓋玻片置于六孔培養(yǎng)板中，各加入濃度為1×106個/ml的細(xì)胞1 ml，按照上述方法培養(yǎng)。將DU145與RWEP-1細(xì)胞按不同處理方法各分為三組：對照組、單純超聲組及超聲聯(lián)合微泡組。

1.2.2 超聲輻照方法

室溫下，將超聲探頭固定于不銹鋼支架上，輻射面垂直向上，將裝有蓋玻片的六孔板的一個孔的中心置于超聲換能器表面，板與換能器間涂有耦合劑，聲強為0.113 W/cm2，占空比為30%，對于對照組，輻照0 min，加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液(100 μl/ml)；對于單純超聲組，輻照2 min，加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液(100 μl/ml)；對超聲聯(lián)合微泡組，輻照2 min，超聲作用前向培養(yǎng)液內(nèi)加入配置好的微泡懸液(100 μl/ml)。

1.2.3 原子力聲顯微鏡(Atomic Force Acoustic Microscope, AFAM)觀察

(1) 細(xì)胞表面形貌的觀察。超聲輻照處理后即刻觀察。細(xì)胞表面用1號探針形貌掃描。對于對照組直接取出蓋玻片，用滴管取蒸餾水沖洗玻片3次，干燥后置于AFAM試樣臺上，在接觸模式下調(diào)節(jié)各項參數(shù)并下針掃描；單純超聲組超聲輻照后觀察；超聲聯(lián)合微泡組加入微泡超聲輻照后，按照同樣方法觀察以獲得細(xì)胞表面形貌像。

(2) 液態(tài)環(huán)境下用2號探針測量細(xì)胞的彈性模量。對于對照組直接取出蓋玻片，蓋玻片上滴上培養(yǎng)液，放置于AFAM試樣臺上，對細(xì)胞核中心區(qū)域作力曲線，設(shè)置懸臂梁最大彎曲量即Trigger Threshold為150 nm，采用Ramp Plot得到力曲線；對于單純超聲組，按照前述方法進行超聲輻照后取出按照同樣方法觀察；對于超聲聯(lián)合微泡組，加入微泡后按照前述方法進行超聲輻照后取出按照同樣方法觀察。每組選取五個細(xì)胞。得到力曲線圖后，為了減小黏附性對彈性模量(楊氏模量)產(chǎn)生的誤差，選用逼近力曲線，并沿用前人在試驗過程中采用公式的Hertz接觸模型計算彈性模量(楊氏模量)[6]。

1.2.4 透射電鏡

各組細(xì)胞輻照后放置24 h，用細(xì)胞刮將玻片上的細(xì)胞刮下，將培養(yǎng)液離心，制備超薄切片后在透射電鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 AFAM細(xì)胞形態(tài)觀察

原子力聲顯微鏡掃描時是結(jié)合了光學(xué)顯微鏡，挑選出目標(biāo)細(xì)胞進行掃描。如圖1所示，A1~C1及A2~C2分別為對照組、單純超聲組、超聲聯(lián)合微泡組的DU145細(xì)胞的形貌圖像及三維立體圖像。對照組的細(xì)胞形態(tài)橢圓，細(xì)胞膜光滑完整，細(xì)胞核居中；單純超聲組細(xì)胞形態(tài)相對飽滿，細(xì)胞膜光滑完整，細(xì)胞膜表面可見細(xì)小的孔狀結(jié)構(gòu)，直徑約1 μm；超聲聯(lián)合微泡組的細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞膜似不完整，可見放射狀纖維樣物質(zhì)，細(xì)胞表面有多個孔狀結(jié)構(gòu)，直徑約5 μm。如圖2所示，D1~F1及D2~F2分別為對照組、單純超聲組、超聲聯(lián)合微泡組的RWPE-1細(xì)胞的高度圖像及三維立體圖像。對照組細(xì)胞呈長橢圓形，細(xì)胞膜光滑完整，細(xì)胞核居中，細(xì)胞間見顯微結(jié)構(gòu)相連；單純超聲組細(xì)胞呈長橢圓形，膜光滑完整；超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞呈類圓形，細(xì)胞表面可見放射狀顯微絲狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜表面可見多個大孔狀結(jié)構(gòu)，直徑約6 μm。

2.2 AFAM液態(tài)環(huán)境下測量細(xì)胞的楊氏模量

細(xì)胞表面形貌成像后對細(xì)胞核中心區(qū)域作力曲線，運用公式計算其楊氏模量。對數(shù)據(jù)進行檢驗。DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞的超聲聯(lián)合微泡組的楊氏模量與各自對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.02、=0.048)；DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞的單純超聲組與對照組的楊氏模量均無統(tǒng)計學(xué)差異(=0.121、=0.542)；RWPE-1細(xì)胞的超聲聯(lián)合微泡組的楊氏模量與單純超聲組楊氏模量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.02、=0.09)；DU145細(xì)胞與RWPE-1細(xì)胞的對照組細(xì)胞的楊氏模量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.042)；DU145細(xì)胞與RWPE-1細(xì)胞的超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞的楊氏模量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=0.199)。細(xì)胞的楊氏模量均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示。

表1 細(xì)胞的楊氏模量均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差±s

Table 1 Mean and standard deviation of cell Young's modulus

表1 細(xì)胞的楊氏模量均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差±s

細(xì)胞類型對照組單純超聲組超聲聯(lián)合微泡組 DU14537.00±6.4446.80±9.7871.20±7.85 RWPE-156.00±12.8252.20±8.9276.20±4.76

2.3 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬

將DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞的空白對照組及低頻低能量超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞進行透射電鏡觀察?？瞻讓φ战M的DU145細(xì)胞和RWPE-1細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核無變化；DU145的低頻低能量超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核未見明顯改變，胞質(zhì)內(nèi)見多個囊樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)包裹部分細(xì)胞器，部分囊狀結(jié)構(gòu)為自噬泡，部分為自噬溶酶體。經(jīng)過低頻低能量超聲聯(lián)合微泡處理過的DU145細(xì)胞可見部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，呈細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，而超聲聯(lián)合微泡組的RWPE-1細(xì)胞未見此表現(xiàn)。

3 討論

本實驗用原子力聲顯微鏡及電鏡觀察低頻低能量超聲聯(lián)合微泡對前列腺癌細(xì)胞系DU145及正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1的作用。原子力聲顯微鏡可對細(xì)胞表面形貌進行納米分析并測量細(xì)胞彈性。其可直接掃描細(xì)胞，從而避免了細(xì)胞制備過程中的復(fù)雜步驟，并可對活細(xì)胞進行觀察[7]。本研究中，通過其對各組細(xì)胞的分析(圖1及圖2)發(fā)現(xiàn)，單純超聲作用后細(xì)胞的表面形貌變化不明顯，而超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞表面出現(xiàn)直徑約5~6 μm的孔狀結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞包膜外見放射狀的顯微絲狀結(jié)構(gòu)。通過液相下接觸模式，同時對各組細(xì)胞的彈性模量進行了測量。從數(shù)據(jù)可以得出前列腺癌DU145細(xì)胞相比正常的前列腺上皮細(xì)胞彈性大，單純超聲作用后細(xì)胞彈性模量變化不顯著，而超聲聯(lián)合微泡作用后兩種細(xì)胞彈性都變小，且超聲聯(lián)合微泡作用后的前列腺癌細(xì)胞較正常前列腺上皮細(xì)胞變化幅度更大，這可能與超聲聯(lián)合微泡作用后細(xì)胞內(nèi)微絲變化有關(guān)[8-10]，在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞硬度增加可能表明細(xì)胞受到了損傷[11]，這可能表示超聲聯(lián)合微泡對Du145細(xì)胞的作用強于RWPE-1細(xì)胞。在觀察到單純超聲對細(xì)胞作用不明顯后，采用透射電鏡觀察對照組及超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞的變化，可見DU145細(xì)胞及RWPE-1細(xì)胞在超聲聯(lián)合微泡作用后都出現(xiàn)了自噬現(xiàn)象(見圖3)。自噬作為細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)時機體所發(fā)生的一種適應(yīng)性變化，在營養(yǎng)條件充足時，基本不出現(xiàn)在細(xì)胞中。自噬的發(fā)生常常有利于細(xì)胞生存，因為自噬的基本功能是將細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)降解后再利用為細(xì)胞提供能量和物質(zhì)[12,13]?？赏茰y超聲聯(lián)合微泡對細(xì)胞造成損傷后，細(xì)胞通過自噬自我修復(fù)，而自噬的發(fā)生于細(xì)胞膜表面出現(xiàn)的孔狀結(jié)構(gòu)，是否由于部分膜蛋白的改變而誘導(dǎo)，還需要進一步的實驗探索。同時在超聲聯(lián)合微泡作用后的DU145細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，呈細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)[14]，而RWPE-1細(xì)胞中未見明顯凋亡細(xì)胞，同時綜合考慮超聲聯(lián)合微泡作用后它們的彈性模量的變化，我們可以得出超聲聯(lián)合微泡對DU145細(xì)胞的作用大于RWPE-1細(xì)胞。

圖3(a) 對照組的Du145細(xì)胞的透射電鏡圖像

Fig.3(a) TEM images of DU145 cell in control group

圖3(b) 對照組的RWPE-1細(xì)胞的透射電鏡圖像

Fig.3(b) TEM images of RWPE-1 cell in control group

圖3(c) 超聲聯(lián)合微泡組的Du145細(xì)胞的透射電鏡圖像，圖中可見自噬溶酶體或自噬泡(箭頭所示)

Fig.3(c) TEM images of DU145 cell treated with ultrasound combined with microbubbles, showing autophagy lysosome or autophagic vacuoles (arrows)

圖3(d) 超聲聯(lián)合微泡組的RWPE-1細(xì)胞的透射電鏡圖像，圖中可見自噬溶酶體或自噬泡(箭頭所示)

Fig.3(d) TEM images of RWPE-1 cell treated with ultrasound combined with microbubbles，showing autophagy lysosome or autophagic vacuoles (arrows)

從實驗結(jié)果可以得出，低頻低能量超聲聯(lián)合微泡可以引起前列腺癌DU145細(xì)胞及前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1的自噬，使細(xì)胞彈性模量發(fā)生改變，且誘導(dǎo)了DU-145凋亡，但卻未誘導(dǎo)正常前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，低頻低能量超聲聯(lián)合微泡似乎是潛在的治療前列腺癌的新方法。

4 結(jié)論

綜上，低頻低能量超聲聯(lián)合微泡可引起前列腺癌DU145細(xì)胞及正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)其自噬，且對DU145細(xì)胞的損傷大于RWPE-1細(xì)胞。

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The effect of low-frequency ultrasound combined with microbubbles on human prostate cells

CHEN Yi-ni, BAI Wen-kun, HU Bing

(Department of Ultrasound in Medicine, The 6th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine, Shanghai 200223, China)

Objective: To explore the impact of 21 kHz low-intensity ultrasound combined with microbubbles on both DU145 cells and RWPE-1 cells by using Atomic force acoustic microscope (AFAM) and Transmission electron microscopy (TEM). Methods: Both DU145 cells and RWPE-1 cells were divided into three groups: control group, ultrasound group and ultrasound combined with microbubbles group. Conditions of the low-frequency and low-energy ultrasound (US) irradiation were: Frequency, 21 kHz; Exposure time, 2 min at a duty ratio of 30%; and the valid treatment time of 84 seconds was used for the combination with microbubbles (100μl/ml). Cells of different groups were imaged in cover slips by AFAM immediately after the intervention. Twenty-four hours after intervention, TEM was used to observe cells. Results: Cellular membrane and three-dimensional structure of both cells showed significant difference in ultrasound combined with microbubbles group compared with control group, while no difference in ultrasound group compared with control group. Compared with control group, the elasticity modulus of both cells in ultrasound combined with microbubbles group was higher, and also the elasticity modulus of DU145 cells was higher than RWPE-1 in ultrasound combined with microbubbles group. Lots of autophagosomes or autolysosomes were detected by TEM in both cells in ultrasound combined with microbubbles group. TEM also demonstrated some apoptosis of DU145 cells in ultrasound combined with microbubbles group. Conclusions: The low-frequency ultrasound combined with microbubbles can induce autophagy in both DU145 cells and RWPE-1 cells, and the injury to DU145 cells is more serious than to RWPE-1 cells.

low-frequency ultrasound;microbubble contrast agent;prostate cancer;Atomic Force Acoustic Microscope(AFAM);autophage

TB566

A

1000-3630(2015)-04-0333-05

10.16300/j.cnki.1000-3630.2015.04.008

2014-12-23;

2015-02-17

國家自然科學(xué)基金項目(81401421)、教育部項目(20120073120100)、上海市科委自然基金面上項目(12ZR1422600)資助。

陳旖旎(1989－), 女, 福建建甌人, 碩士研究生, 研究方向為原子力聲顯微鏡的應(yīng)用。

胡兵, E-mail: binghu_stephen@163.com