魯燕濱，王玉鳳，陳 林，吳紅萍

（1.海南伊順?biāo)帢I(yè)有限公司，海南 ?？?571127；2.海南國健生物工程有限公司，海南 海口 570125；3.遵義醫(yī)學(xué)院 生物工程系，貴州 遵義 563003；4.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158）

兩種測定水飛薊膠囊中水飛薊素含量方法的比較分析

魯燕濱1，王玉鳳2，陳 林3，吳紅萍4*

（1.海南伊順?biāo)帢I(yè)有限公司，海南 海口 571127；2.海南國健生物工程有限公司，海南 ?？?570125；3.遵義醫(yī)學(xué)院 生物工程系，貴州 遵義 563003；4.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158）

以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色譜法（HPLC）對利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊中的總黃酮含量進(jìn)行分析.結(jié)果表明：兩種方法可用于測定水飛薊膠囊中總黃酮含量，簡單快速，重現(xiàn)性好.

總黃酮含量；含量測定；紫外分光光度法；高效液相色譜法

中藥水飛薊又名乳薊子，老鼠筋等，為菊科水飛薊屬草本植物，其全草或果實(shí)（種子）可供藥用[1].具有清熱解毒、保肝護(hù)肝、利膽保腦的功能是制造益肝靈、利加隆膠囊、水飛薊賓膠囊等保肝利膽藥的重要原料[2-3].水飛薊素是從水飛薊干燥種子中提取精制而得到的黃酮類混合物，主要由3種異構(gòu)體組成：水飛薊賓（silybin）、水飛薊寧（silydianin）、水飛亭（sily?christin）[4].水飛薊素在臨床上廣泛用于治療急、慢性肝炎、肝硬化以及肝損傷，隨著藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)展和完善，胡帆等發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤、降血脂、治療糖尿病等作用[5].隨著水飛薊素藥用功能及特殊性能的不斷被發(fā)現(xiàn),水飛薊素的經(jīng)濟(jì)價(jià)值穩(wěn)步提高.近年來，國內(nèi)外有關(guān)專家、學(xué)者已對水飛薊素活性成分與藥理作用進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究.早期文獻(xiàn)中較多關(guān)于水飛薊賓含量測定的報(bào)道，多是以薄層掃描和分光光度法進(jìn)行，目前對水飛薊素的主要有效成分的分離測定主要采用薄層色譜掃描法和高效液相色譜法[6-8].由于水飛薊素主要從水飛薊種子種提取，多為黃酮類化合物，故一般水飛薊素含量用總黃酮量計(jì)算[9]，但目前有關(guān)利用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定水飛薊素（總黃酮含量）比較分析的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道.隨著科技的發(fā)展，儀器分辨率的進(jìn)一步提高，紫外分光光度法和高效液相色譜法在藥學(xué)界的廣泛應(yīng)用，使得藥品的定性定量分析更加準(zhǔn)確.本研究采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定水飛薊膠囊中總黃酮含量的方法學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究，為評價(jià)總黃酮含量的測定方法奠定基礎(chǔ)，為建立快速、準(zhǔn)確的總黃酮含量測定的方法學(xué)提供幫助.

1 儀器試劑與材料

儀器：紫外分光光度計(jì)（UV-2550，日本島津）；高效液相色譜儀（HPLC-2010A，日本島津）；自動(dòng)雙重純水蒸餾器（SZ-93，上海亞榮儀器設(shè)備有限公司）.

試劑：甲醇（色譜純，美國Sigma），氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）.

材料：市售利加隆水飛薊膠囊（德國Madus公司）和GNC水飛薊膠囊（美國GNC公司）；對照品：蘆?。ㄖ袊幤飞镏破疯b定所）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的制備

精密量取減壓干燥至恒重的蘆丁對照品10mg于100mL容量瓶中，加75%的甲醇定容至刻度，充分搖勻.取上清液用微孔濾膜器（0.45 um濾膜）過濾，即得蘆丁的濃度為0.1mg/mL.

2.2 測定波長的選擇

取0.1mg/mL蘆丁對照品溶液，以甲醇為空白對照，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描，確定蘆丁最大吸收波長，繪制蘆丁對照品溶液的紫外吸收圖譜.

2.3 蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL蘆丁對照品溶液分別于10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉6滴，搖勻后靜置6 min；加10%硝酸鋁6滴，搖勻后靜置6 min；加4%氫氧化鈉4.0mL；最后加75%甲醇至刻度，搖勻后靜置15 min，制備的蘆丁對照品濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL，采用紫外分光光度法，以甲醇為空白對照，以蘆丁對照品溶液最大吸收波長為檢測波長測定其含量，以紫外吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以濃度對吸光值進(jìn)行線性回歸.另外制備0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL對照品溶液，然后用微孔濾膜器（0.45 um濾膜）過濾，采用高效液相色譜法測定其含量，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸.色譜條件（色譜柱：RH-C18，柱溫：30℃，流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60），流速：1mL/min，檢測波長：341 nm，進(jìn)樣量：10 uL）.

2.4 樣品溶液的制備

2.4.1 紫外分光光度法

分別精密稱取利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊兩種藥物1.0 g于100mL容量瓶中，加75%的甲醇至刻度，搖勻.準(zhǔn)確量取1mL于10mL容量瓶中，然后照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)方法加入顯色劑，利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊終濃度為1mg/mL.

2.4.2 高效液相色譜法

分別精密稱取稱取利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊兩種藥物5mg于100mL容量瓶中，加75%的甲醇至刻度，搖勻.取上清液用微孔濾膜器（0.45 um濾膜）過濾，得兩種藥物的濃度均為0.05mg/mL.

2.5 樣品中水飛薊素含量的測定

分別采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊樣品溶液中水飛薊素的含量.并進(jìn)行精密度（連續(xù)測定3次）、穩(wěn)定性試驗(yàn)（放置0 h、12 h、24 h）和重復(fù)性試驗(yàn)（3份同一批樣品），并分別計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)的RSD.

連續(xù)測定樣品溶液3次進(jìn)行精密度試驗(yàn)，測定樣品溶液放置0 h、12 h、24 h后進(jìn)行穩(wěn)定性試，取同一批藥物3份，按上述方法配制樣品溶液并測定，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn).最后分別計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)的RSD.

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁對照品溶液的最大吸收波長

從圖1紫外吸收光譜圖可以看出，蘆丁對照品溶液在341 nm處具有最大吸收峰.同樣在此檢測波長下，利用高效液相色譜法測定蘆丁對照品溶液時(shí)同樣出現(xiàn)最高峰.

圖1 蘆丁對照品溶液的紫外吸收光譜Fig.1 The UV absorption spectrum of rutin solution

3.2 蘆丁對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖3、4的蘆丁對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的回歸方程可以看出，紫外分光光度法和高效液相色譜法測定蘆丁對照品溶液分別在0.00～0.08mg/mL和0.02～0.10mg/mL蘆丁對照品溶液濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.997，說明在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

圖2 蘆丁對照品溶液的高效液相色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of rutin solution

圖3 蘆丁對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線（紫外分光光度法）Fig.3 The standard curve of rutin solution

圖4 蘆丁對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線（高效液相色譜法）Fig.4 The standard curve of rutin solution

3.3 樣品溶液的紫外吸收光譜

從利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊兩種藥物的紫外光譜圖（圖5-6）可以看出兩種藥物均含有黃酮類化合物，且在341 nm波長下均有吸收峰，其含量可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算.

圖5 利加隆水飛薊膠囊的紫外吸收圖譜Fig.5The UV absorption spectrum of medicine A

圖6 GNC水飛薊膠囊的紫外吸收圖譜Fig.6The UV absorption spectrum of medicine B

3.4 樣品溶液的高效液相色譜圖

從利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊兩種藥物的高效液相色譜圖（圖7-8）可以看出兩種藥物在341 nm波長下均有最高吸收峰，且最高峰為水飛薊素，以該峰的面積作為定量分析，其含量可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算.

3.5 水飛薊素含量測定結(jié)果

由表1可以看出，利用紫外分光光度法和高效液相色譜法測得的利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊中的水飛薊素含量存在一定的差異性，利加隆水飛薊膠囊中的水飛薊素含量略高于GNC水飛薊膠囊中的水飛薊素含量.利用高效液相色譜法測定兩種膠囊中的水飛薊素含量均低于用紫外分光光度法測定的含量，這可能和紫外分光光度法不具備分離功能，測定的含量為所有黃酮類的化合物，并非特指水飛薊素的含量.

圖8 GNC水飛薊膠囊的高效液相色譜圖Fig.8High performance liquid chromatography（HPLC）figure of GNC milk thistle capsules

表1 兩種水飛薊膠囊中水飛薊素含量測定的結(jié)果Tab.1 The results silymarin contents determination of two silymarin capsules by two metheys

3.6 不同方法測定水飛薊素含量的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性結(jié)果

從表2可以看出，利加隆水飛薊膠囊和GNC水飛薊膠囊中水飛薊素含量測定的兩種方法學(xué)（UV和HPLC）的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均符合藥品檢測方法學(xué)的要求.藥品檢測方法學(xué)一般規(guī)定利用紫外分光光度法和高效液相色譜法檢測的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD應(yīng)分別分別控制在2%和1.5%以內(nèi)，因此兩種方法均可用于水飛薊膠囊中的水飛薊素含量的測定.

表2 兩種水飛薊素含量測定的方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2Two kinds of methodology for the determination of silymarin contents inspection results

4 討論

水飛薊素為黃酮類化合物，其檢測大多用薄層色譜法，該方法操作不便，條件要求苛刻，不易控制，并且不能定量[10-12]，本研究分別采用紫外分光光度法及高效液相色譜法兩種方法對兩種水飛薊膠囊中總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明兩種檢測方法均符合藥品檢測的相關(guān)規(guī)定.采用UV法和HPLC法檢測總黃酮含量較薄層色譜法方便快捷，既可用于定量分析，也可用于定性分析.

采用紫外分光光度法和高效液相色譜法測定水飛薊膠囊中的總含黃酮含量結(jié)果表明紫外分光光度法的測定值高于高效液相色譜法，其原因在于紫外分光光度法不具備分離功能，測定的是總黃酮的吸光值，即膠囊中所有的黃酮類化合物；而高效液相色譜法兼有分離和測定兩種功能，測定的結(jié)果是單一組分即水飛薊素的含量.但就本研究而言，由于水飛薊膠囊中保肝作用的主要成分是黃酮類化合物[13]，對藥物中總黃酮的測定作為制劑的質(zhì)量指標(biāo)具有較好的代表性，因此紫外分光光度法在水飛薊膠囊總黃酮的定量中也顯示出非常好的實(shí)用價(jià)值.因此，本研究采用的兩種測定水飛薊膠囊中總黃酮含量方法均適用于該類產(chǎn)品的檢測，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.參考文獻(xiàn):

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[4]2009,25（10）:19-19.常鳳崗,董國平,吳知行,等.水飛薊化學(xué)成分的研究[J].南

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責(zé)任編輯：黃 瀾

Two Methods of Determination of Silymarin Content in Silymarin Capsule of Comparative Analysis

LU Yanbin1，WANG Yufeng2，CHEN Lin3，WU Hongpin4＊
（1.Hainan Yi Shun Pharmaceutical Co.，Ltd，Haikou571127，China；2.Hainan State-Biological Engineering Co.，Ltd.，Haikou571025，China；3.Department of biological engineering，Zunyi Medical College，Zunyi563003，China；4.College of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

In this study,we detected total flavonoids in Silymarin Capsules manufactured in Lijialong and GNC with UV and HPLC as detection methods and rutin as reference substance.UV and HPLC can both be used for the determination of total flavonoids in Silymarin Capsules with good repeatability.They are simple,fast and can have good accuracy in qualita?tive and quantitative analysis.

Total flavonoids；Content Determination；UV；HPLC

R 9

A

1674-4942(2015)02-0164-05

2015-02-27

*通訊作者