王 立，王 敏，馬 放，李 哲，吳潔婷，安廣楠

(城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學)，150090哈爾濱)

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，根腐?。?-2］是影響小麥生產(chǎn)的主要病害類型［3］，主要由播種過深、營養(yǎng)不平衡、凍傷、大水漫灌、調(diào)用帶病的麥種等因素造成［4］.據(jù)統(tǒng)計根腐病可引起小麥減產(chǎn)達15%～20%，經(jīng)濟損失嚴重，因而對小麥根腐病的防治一直很受重視［5-6］.目前，針對小麥根腐病的防治對策主要以化學農(nóng)藥拌種為主［7］，但農(nóng)藥殘留超標會引發(fā)食品安全問題，且農(nóng)藥施加過量會引起嚴重的面源污染.因此，亟需一種安全、環(huán)保、有效的防治小麥根腐病的方法.

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)是植物根系與叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)形成的共生體，能夠有效增強作物的物質(zhì)生產(chǎn)和抗病能力［8］，近些年在“綠色肥料”和“綠色農(nóng)藥”開發(fā)領(lǐng)域具有巨大潛力［9-11］.叢枝菌根是菌根中分布最廣泛、發(fā)生率最高的一類菌根.已有研究表明，一方面，叢枝菌根真菌侵染條件下能夠有效促進宿主對土壤中礦質(zhì)元素的吸收［12］，增加根際土壤中微生物的數(shù)量，改善植物的碳、氮、磷素營養(yǎng)狀況［8］，促進植物生長，改善作物品質(zhì);另一方面，AM能在宿主植物根際形成大量外生菌絲，大大擴展了根系吸收面積，使宿主植物生長健壯，生命力旺盛，從而增強其抗性［13］.因此，有望在作物病害防治方面發(fā)揮重要作用.本研究選擇叢枝菌根真菌中分布廣泛、可與多種宿主形成良好共生關(guān)系的普適性菌種——摩西球囊霉作為優(yōu)選菌劑，定量分析其在小麥生長及根腐病防治過程中可能發(fā)揮的重要作用.

1 試驗

1.1 試驗材料

在城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室模擬自然人工氣候室中進行盆栽試驗.試驗時間為2013年3月25日～2013年9月28日.氣候條件:室內(nèi)平均氣溫為20.8℃，空氣相對濕度為(42±0.12)%.

供試菌劑:廣適叢枝菌根真菌——摩西球囊霉(Glomus mosseae)，來自黑龍江大學生命科學學院，孢子數(shù)為23個·g-1.供試基質(zhì):田間滅菌土壤，水解性氮112.24 mg/kg，有 效 磷399.78 mg/kg;pH 為 6.5.

盆栽試驗:花盆高12 cm，盆口直徑10 cm，盆底直徑8 cm.試驗前用75%的酒精溶液浸泡30 min，2 h 后加入相應基質(zhì) 0.35 kg.

植物宿主:小麥(Triticumaestivum)，品種為東農(nóng)024，購于黑龍江省農(nóng)科院.種子用體積分數(shù)為0.1%高錳酸鉀液浸種30 min進行表面消毒，然后用蒸餾水浸泡24 h，30℃保濕催芽.待芽長至1 cm左右時，篩選芽長基本一致的小麥種子10粒均勻地撒在小花盆中，表面覆土約2 cm，每天早晚澆水兩次.

1.2 試驗設計及方法

試驗設置AMF空白基質(zhì)(-GM-AA)、AMF空白基質(zhì)接種根腐病菌(-GM+AA)以及AMF強化基質(zhì)接種根腐病菌(+GM+AA)3個組別，采用菌劑與土壤基質(zhì)均勻混合的方式，各組基質(zhì)均經(jīng)過壓力0.15 MPa、溫度121℃條件下蒸氣滅菌2 h.AMF強化基質(zhì)中每盆接種10 g有效菌劑，空白基質(zhì)中添加10 g菌劑的濾紙濾液，用以確保3個組別除菌根真菌以外微生物群落的一致性.每個組別設置10個重復.所有基質(zhì)灌水至盆底有水溢出，而后移栽小麥幼苗，參考大田種植密度規(guī)劃每盆10株.

1.2.1 AMF 接種及測定

接種:將種子均勻撒入混合基質(zhì)中，表面覆土約1 cm.

侵染率測定:采樣時間為小麥幼苗自然生長4周后.隨機選取100條約2 cm長根尖根段染色［12］、制片、觀察，并根據(jù)十字交叉法計算菌根侵染率［13-14］.

1.2.2 菌根依賴性計算

根據(jù)Nemec［15］的分類方法，將植物對菌根的依賴度分為3級:菌根依賴指數(shù)為300%時為高強度依賴性，200%時為中等強度依賴性，100%時為弱依賴性或無依賴性.

1.2.3 AMF 對植物生長的影響

分別測量AMF強化處理組小麥苗的株高、地上及地下生物量、根總表面積，與空白試驗組作對比，研究AMF對植物生長的影響，計算植物菌根依賴指數(shù).

1.2.4 AMF 對植物抗/耐病性的影響

根據(jù)植物發(fā)病情況分別計算植物的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)［16-17］，測量可溶性蛋白 MDA(丙二醛)、游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)以及SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)等體現(xiàn)植物逆性的指標，與對照組(CK)比較，探究AMF對小麥抵抗根腐病的作用.

根據(jù)劉惕若等［18］對植物根腐病病情的分類標準，可計算出植株病情指數(shù)，即

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Ducan多重比較檢驗各處理間的差異，統(tǒng)計學意義水平為5%.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根侵染率和菌根依賴性分析

不施加菌劑的對照組(CK)中，仍可檢測出AMF對小麥根部的侵染，表明自然基質(zhì)中土著AMF普遍能夠與小麥形成共生體，但侵染率很低(3.25%).

相比CK組，施加菌劑可顯著提高AMF對小麥的侵染作用(P＜0.05).經(jīng)測定，接種后摩西球囊霉的侵染率可達42.2%，約為空白基質(zhì)組的14倍.結(jié)果表明，摩西球囊霉對小麥的侵染效果極佳(P＜ 0.05).

AMF對小麥的侵染作用可有效提高小麥(地上及地下)對AMF的菌根依賴性指數(shù).

將不施加菌劑的對照處理(CK)植物組的菌根依賴指數(shù)設為100%，相比于CK，施加菌劑摩西球囊霉植物組的菌根依賴性指數(shù)(P＜0.05)為149%，約為未施加菌劑組的1.5倍，說明小麥根系對摩西球囊霉具有較強的依賴性.

為進一步揭示菌根真菌對植物生長的促進作用，將植物生長對菌根真菌的依賴性劃分為地上和地下兩部分.與CK相比，施加菌劑可顯著提高植物地上、地下部分的菌根依賴性(P＜0.05).其中，小麥地上、地下部分對菌劑摩西球囊霉的依賴性分別為123%，166%，均為中等強度依賴［17］.由表1可以看出，小麥地下部分對菌劑的依賴性明顯高于地上部分.

表1 AMF對小麥侵染率、菌根依賴性、地上及地下菌根依賴性的影響 %

2.2 AMF對小麥營養(yǎng)生長的影響

2.2.1 AMF接種對小麥株高的影響

株高是反應小麥營養(yǎng)生長狀況最易獲得且最明顯的指標.分別測量了小麥生長第 10天，30天，60天，90天，120天AMF強化基質(zhì)處理組小麥的株高，并與CK對比，結(jié)果見圖1.可以看出，植物株高隨時間變化呈現(xiàn)先加速而后趨于平緩的二次曲線規(guī)律.其中AMF強化組小麥株高在各個時期均顯著高于CK組，具體參數(shù)見表2.

圖1 AMF對小麥株高的影響

表2 小麥株高－時間變化動態(tài)

從表2擬合方程可以看出:

1)AMF接種植物生長更旺盛，以曲線的初始斜率表征植物增長速率，GM組與CK組增長速率分別為 40.23%、27.29%，提高了約 13%，表明接種植物較非接種植物更早達到生長旺盛期.

2)AMF可顯著促進植物營養(yǎng)生長，其最大株高較非接種植物高8 cm(約30%).

3)兩組處理的擬合曲線最高值分別為33.94，25.71，達到最大值的天數(shù)分別為 72，115 d.增長速率分別為 40.23%、27.29%，圖 1中陰影部分為菌劑的促進效應.結(jié)果表明，AMF強化組增長速率更快，最大值遠大于CK組，且更早達到最大值，說明AMF能夠使小麥營養(yǎng)生長長勢更好，生長更迅速.

2.2.2 AMF接種對小麥總生物量及根系總表面積的影響

相比CK組，施加菌劑后可顯著提高小麥的地上、地下生物量(P＜0.05)，對小麥地上部分的促進作用尤為明顯(P＜0.05).施加摩西球囊霉后，植物地上、地下生物量分別提高38.9%、82.3%.說明摩西球囊霉菌劑能夠有效促進同化物質(zhì)的積累，特別在促進根系發(fā)育方面效果顯著，結(jié)果見圖2.

施加摩西球囊霉菌劑后，小麥根部總表面積明顯高于未施加菌劑的CK組(P＜0.05).說明自然條件下形成的少量AM菌根結(jié)構(gòu)不能明顯增大根系的營養(yǎng)吸收面積，而施加了AMF后根系總表面積比 CK 增大了 40.33%［18］，見圖 3.由于大量菌絲存在增大了小麥根系的總表面積，提高了營養(yǎng)吸收效率，保證了小麥旺盛生長以及良好的抗逆性.

圖2 AMF對小麥地上、地下生物量的影響

圖3 AMF對小麥生物量及根系表面積的影響

2.3 AMF對小麥抗逆性能的提高

可溶性蛋白 MDA(丙二醛)、游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)以及SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)等植物生理脅迫指標的變化，可以間接反映AMF菌對植物抗/耐病性的影響，結(jié)果見表3.

表3 AMF對植物各生理脅迫指標的影響

可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)、游離PRO質(zhì)量分數(shù)、SOD活性、POD活性與植物抗逆性呈正相關(guān)，MDA質(zhì)量摩爾濃度與抗逆性呈負相關(guān)［19］.由表3可知，與空白基質(zhì)組相比，AMF強化組與抗逆性正相關(guān)的參數(shù)均有明顯提高(P＜0.05)，分別提高 66.9%、50.2%、84.6%、81.8%，MDA 質(zhì)量摩爾濃度明顯下降64.2%(P＜ 0.05)，說明 AMF菌劑對于改善小麥性質(zhì)機能、增強自身抗病能力具有顯著效果(P＜0.05).

2.4 AMF對小麥根腐病的增抗效果

圖4分別為添加AMF組(+GM+AA)和未添加AMF組(-GM+AA)小麥根腐病菌侵染小麥根部情況圖.從表觀上可以看出，兩組均出現(xiàn)不同程度的枯黃甚至腐爛，但前者發(fā)病情況明顯輕于后者，說明AMF可以保護植物根部，對小麥根腐病有一定的增抗效果.

根據(jù)植物發(fā)病情況分別計算小麥植株的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)［20］，考察菌根作物與非菌根作物抗病能力的差異，結(jié)果見表4.

各實驗組接種根腐病菌后，與CK相比，發(fā)病率及病情指數(shù)均有增加.但施加AMF菌劑組小麥植株的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)明顯低于空白基質(zhì)組(P＜ 0.05)，分別降低 38%、3.74.

圖4 小麥根部根腐病發(fā)病情況

表4 AMF對小麥根腐病的增抗效果

3 結(jié) 論

1)小麥能夠與AMF形成菌根共生體AM.人工接種AMF菌劑可顯著提高小麥根部AMF侵染率.摩西球囊霉對小麥根部侵染率為42.2%，約為自然條件的14倍，其菌根依賴性指數(shù)高達149%，約為未施加菌劑組的1.5倍，且其地下部分對菌劑的依賴性明顯高于地上部分.

2)人工施加AMF菌劑，可顯著促進小麥的營養(yǎng)生長，其株高、地上及地下生物量、根系總表面積均顯著提高，分別增加 26.67%、38.9%、82.3%、20.33%，這一結(jié)論為菌根技術(shù)用于“綠色肥料”生產(chǎn)奠定了基礎.

3)施加AMF菌劑后，可顯著降低小麥植株的發(fā)病率、發(fā)病指數(shù)以及與植物抗逆性成負相關(guān)的生理指標參數(shù)(P＜0.05)，且大幅度提高與植物抗逆性呈正相關(guān)的生理指標參數(shù)(P＜0.05)，對小麥根腐病具有良好的防治效果，在應用于“綠色農(nóng)藥”開發(fā)領(lǐng)域具有巨大潛力.

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