劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 夏 煒, 郭樹(shù)忠, 魯開(kāi)化

過(guò)氧乙酸對(duì)脫細(xì)胞血管支架生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 夏 煒, 郭樹(shù)忠, 魯開(kāi)化

目的 探討使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%過(guò)氧乙酸處理脫細(xì)胞血管支架的生物相容性和生物力學(xué)特征，觀察其作為生物材料消毒劑對(duì)于脫細(xì)胞血管支架材料生物特性的影響。方法 選取2.0～2.5 kg大耳白兔10只，在無(wú)菌條件下切取新鮮的兔股動(dòng)脈,經(jīng)反復(fù)凍融與超高壓處理后，以15 μg/ml R-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ 核酸酶進(jìn)行脫細(xì)胞處理，室溫下放置于體積分?jǐn)?shù)為0.1%過(guò)氧乙酸溶液中3 h，對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，觀察其超微結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)，以及細(xì)胞毒性的測(cè)定。結(jié)果 經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.1%過(guò)氧乙酸處理后的脫細(xì)胞血管支架，在組織結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)及細(xì)胞毒性方面與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。結(jié)論 采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%過(guò)氧乙酸處理脫細(xì)胞血管支架，對(duì)其生物相容性和生物力學(xué)特性無(wú)明顯影響，或許可以作為脫細(xì)胞組織工程血管生物支架消毒劑的一種選擇。

組織工程血管; 過(guò)氧乙酸; 脫細(xì)胞血管支架; 消毒

脫細(xì)胞血管基質(zhì)因其保留了細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)和成分,具有低免疫原性、機(jī)械性能良好、促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)和組織再生的優(yōu)良特性,是一種理想的組織工程血管支架材料,因此,在血管組織工程中得到越來(lái)越多的重視和應(yīng)用[1-2]。但是,脫細(xì)胞血管支架的研究應(yīng)用,也面臨著傳播供體潛在疾病以及在移植物處理應(yīng)用過(guò)程中二次污染的問(wèn)題。傳統(tǒng)的生物材料滅菌方法存在操作要求條件較高，過(guò)程較復(fù)雜,以及可能降低材料的機(jī)械強(qiáng)度等缺點(diǎn)[3-5]。因此，我們希望尋找一種操作簡(jiǎn)便、滅菌效果確實(shí)、費(fèi)用低廉、殘留低,且對(duì)材料性能影響較小的脫細(xì)胞血管支架消毒辦法。過(guò)氧乙酸(peracetic acid, PAA)是一種強(qiáng)氧化劑，它的自然降解產(chǎn)物無(wú)毒或低毒,是其作為滅菌劑的一大優(yōu)點(diǎn)。自2011年9月至2012年6月，我們將體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA作為脫細(xì)胞血管支架的消毒劑，對(duì)經(jīng)PAA處理的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行相關(guān)特性的測(cè)定，旨在觀察過(guò)氧乙酸對(duì)脫細(xì)胞血管支架材料生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑來(lái)源

選取2.0～2.5 kg大耳白兔10只 (第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)，核糖核酸酶(R-Nase A)、脫氧核糖核酸酶(D-Nase I)、40%PAA(美國(guó)SIGMA公司)。

1.2 方法

1.2.1 脫細(xì)胞血管支架的制備 在麻醉及無(wú)菌條件下取出兔股動(dòng)脈(20根)，去除血管外膜后，置入液氮罐中,-196 ℃,1 h,37 ℃水浴復(fù)溫15 min。上述凍融過(guò)程反復(fù)進(jìn)行3次；將反復(fù)凍融的血管材料，以D-Hank液洗凈后放入特制的塑料袋中，袋中浸滿D-Hank液；將塑料袋置入超高壓機(jī)器中，5.065×105kPa (4 ℃)處理10 min后，在無(wú)菌條件下將內(nèi)層特制塑料袋中的血管取出,并置入含有15 μg/ml R-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ 溶液中，沖洗48 h(37 ℃,5% CO2環(huán)境內(nèi)攪拌)，然后用PBS沖洗1 d[6]。

1.2.2 脫細(xì)胞血管支架的PAA處理 將40%PAA溶液,以無(wú)菌PBS溶液稀釋成體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，用滴定法(1N的NaOH)將溶液pH值調(diào)至7.0～7.4；將制備的脫細(xì)胞血管支架10根，室溫下放置于體積分?jǐn)?shù)為0.1%的PAA溶液中3 h;另外10根作為未處理的對(duì)照組，同等條件下放置于滅菌PBS溶液中3 h。脫細(xì)胞血管材料經(jīng)PAA處理完畢后，在滅菌PBS溶液中沖洗3次，每次30 min。所有材料處理完畢后，無(wú)菌保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.3 兔血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取兔股靜脈>20 cm，6 h內(nèi)進(jìn)行分離、培養(yǎng),取培養(yǎng)出的5～6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4 接觸細(xì)胞毒性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組：將約3 mm×3 mm 的無(wú)菌醫(yī)用粘合膜粘貼于一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，然后在無(wú)菌條件下取5 mm×5 mm大小PAA消毒處理過(guò)的脫細(xì)胞血管基質(zhì),黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。對(duì)照組：將1滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養(yǎng)皿中央的醫(yī)用粘合膜上；再將準(zhǔn)備的內(nèi)皮細(xì)胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)孵育48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞與培養(yǎng)皿中央材料毗鄰部位的形態(tài)。1.2.5 材料提取物及不同濃度PAA細(xì)胞毒性測(cè)定 ⑴取PAA消毒處理的脫細(xì)胞血管支架100 mg，用無(wú)菌剪刀盡可能地剪碎，將組織碎片放入可密封消毒試管中，稱重，加入DMEM培養(yǎng)液200 ml(2 ml/mg組織)。密封試管于37 ℃孵育96 h，離心4000 r/min, 20 min,取上清液,經(jīng)0.2 μm濾器過(guò)濾后測(cè)定體積。將提取液與DMEM按照1∶1，1∶4，1∶6,1∶12的體積比稀釋;將0.2%PAA與DMEM按照1∶1，1∶4，1∶6,1∶12的體積比稀釋。然后，將混合溶液分別稀釋為0.1%、0.04%、0.003%、0.0015%,以驗(yàn)證不同濃度PAA的細(xì)胞毒性。⑵用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。以上每個(gè)試驗(yàn)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)定陰性對(duì)照孔(DMEM培養(yǎng)液100 μl)和空白孔(無(wú)細(xì)胞)，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均A值。

1.2.6 經(jīng)PAA處理的脫細(xì)胞血管支架材料的膠原含量測(cè)定 羥脯氨酸含量測(cè)定：經(jīng)PAA處理以及未處理脫細(xì)胞基質(zhì)材料各取50 mg，利用Edwards and O′Brien法[7]，測(cè)量材料的膠原含量。

1.2.7 處理前后材料機(jī)械力學(xué)特性的測(cè)定 ⑴最終抗張強(qiáng)度(ultimate tensile strength, UTS )。利用張力實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)定經(jīng)PAA處理前后材料的UTS(西安交通大學(xué)工程力學(xué)系機(jī)械結(jié)構(gòu)強(qiáng)度與振動(dòng)，國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室MTS-858雙軸液壓生物材料試驗(yàn)機(jī))。⑵縫線保留測(cè)試。利用張力實(shí)驗(yàn)機(jī)，完成對(duì)經(jīng)PAA處理前后材料的縫線保留測(cè)試實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞血管基質(zhì)的組織學(xué)觀察

脫細(xì)胞血管的管壁纖維波浪狀結(jié)構(gòu)均保存基本完好，支架中完全去除了血管中的細(xì)胞成分。

2.2 材料細(xì)胞毒性

2.2.1 材料接觸性細(xì)胞毒性 經(jīng)過(guò)PAA處理的脫細(xì)胞血管材料無(wú)細(xì)胞毒性，在材料周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的接觸或者生長(zhǎng)抑制。陽(yáng)性對(duì)照組材料周?chē)募?xì)胞，則出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)及接觸抑制，并出現(xiàn)大量的細(xì)胞壞死和漂浮(圖1，2)。

2.2.2 材料提取物細(xì)胞毒性 ⑴材料提取物的細(xì)胞毒性見(jiàn)表1。根據(jù)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)內(nèi)，材料提取液不同稀釋比例，各組對(duì)于細(xì)胞的抑制作用與正常組比較差異，無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵不同稀釋濃度的PAA細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度低于或等于0.003%的PAA，其細(xì)胞的毒性與正常組比較，差異無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PAA處理后材料與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)(×40) 圖2 帶有氰基丙烯酸酯的粘合膜與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)(×40)

Fig 1 Co-culture of endothelial cells and material treated with PAA vascular (×40). Fig 2 Co-culture of endothelial cells and cyanoacrylates treated with adhesive film (×40).

2.3 材料的膠原含量測(cè)定

見(jiàn)表3。

2.4 材料的機(jī)械力學(xué)特征

材料的UTS，以及縫線保留測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

作為組織工程血管研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，脫細(xì)胞血管支架在組織工程血管研究領(lǐng)域，一直有著比較廣泛的應(yīng)用。但是，與其他異體或異種的組織移植物一樣，脫細(xì)胞血管支架的研究應(yīng)用也面臨著傳播供體潛在疾病，以及在移植物處理應(yīng)用過(guò)程中二次污染的問(wèn)題。因此，滅菌處理也是高效、快速、安全制備脫細(xì)胞組織工程血管支架材料的一個(gè)非常重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的生物材料滅菌方法主要有以環(huán)氧乙烷為代表的化學(xué)法和以Co60照射為代表的電離輻射法。這兩種通用的滅菌方法有著毋庸質(zhì)疑的滅菌效果，但它們也存在著改變材料生物化學(xué)特性，降低材料生物力學(xué)強(qiáng)度等問(wèn)題[7]。而能夠達(dá)到滅菌效果的足夠劑量的Co60照射處理，明顯降低了生物材料的生物力學(xué)強(qiáng)度。因此，我們?cè)O(shè)想能夠找到一種操作簡(jiǎn)便，滅菌效果確實(shí)，費(fèi)用低廉，殘留低，且對(duì)材料的生物力學(xué)及生物化學(xué)性能影響較小的脫細(xì)胞血管支架的消毒辦法。

目前，對(duì)于PAA的研究主要集中在其滅菌效能上，而其對(duì)材料生物學(xué)特征影響的研究則較少。有研究表明，體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA是對(duì)生物移植物消毒滅菌的最佳濃度[8-9]，而其作為生物材料的消毒劑，則最早應(yīng)用于骨及心臟瓣膜組織[10-12]，以及處理人的脫細(xì)胞臏韌帶和測(cè)定其對(duì)韌帶組織生物相容性及生物力學(xué)特征的影響[13]。結(jié)果表明，經(jīng)PAA處理前后的韌帶組織，其生物學(xué)特性無(wú)明顯改變。而PAA對(duì)于脫細(xì)胞血管基質(zhì)支架的此類(lèi)管狀生物材料及材料生物力學(xué)和化學(xué)特性影響的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。因此，我們的研究中，將可以作為骨骼、瓣膜、韌帶等片狀生物材料消毒劑的PAA，應(yīng)用到脫細(xì)胞血管支架的此類(lèi)管狀生物材料的消毒制備中。在每一種新的生物材料消毒滅菌方法應(yīng)用前，除了其滅菌效能以外，對(duì)于生物材料的生物學(xué)特性影響，也是非常重要的考察指標(biāo)。因?yàn)檫@些生物學(xué)特性對(duì)于生物材料日后的應(yīng)用起著非常重要的作用。另外，使用的消毒滅菌試劑在材料的殘留以及是否與材料發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，亦是重要的考察指標(biāo)。因此，我們?cè)谘芯恐袑?duì)體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA處理的兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的上述指標(biāo)進(jìn)行了體外測(cè)試。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，其材料毒性并未明顯增加(接觸以及細(xì)胞提取物)；細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，與其共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖旺盛，大量細(xì)胞長(zhǎng)入材料內(nèi)部。由此看出，經(jīng)過(guò)處理后的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，在體外依然具有良好的生物相容性。

脫細(xì)胞血管基質(zhì)的主要成分為膠原纖維，而膠原纖維的主要分解產(chǎn)物為羥脯胺酸。因此，我們通過(guò)測(cè)定PAA處理前后材料羥脯胺酸的含量，初步判斷體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA是否與材料發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PAA處理前后的脫細(xì)胞血管支架，其羥脯胺酸含量基本一致，從而可以初步表明，PAA未與脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料發(fā)生明顯的生物化學(xué)反應(yīng)。

表1 不同稀釋濃度材料提取液作用后EC吸光度變化

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h培養(yǎng)36h原液0.58±0.03*◇0.58±0.01*0.57±0.01*◇1∶40.59±0.01*0.66±0.11*0.70±0.09◇1∶60.61±0.05*◇0.62±0.13*◇0.62±0.07◇1∶80.60±0.03◇0.67±0.090.66±0.14◇M1990.63±0.01*0.64±0.01*0.59±0.05*PBS0.11±0.00*0.11±0.00*0.11±0.00*

注：*同一時(shí)段相鄰各濃度組間比較，P>0.05；◇同一濃度不同 時(shí)間的組間比較，P>0.05

表2 不同濃度PAA作用后EC吸光度變化

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h培養(yǎng)36h0.1000%0.06±0.01*0.05±0.02*0.05±0.01*0.0400%0.27±0.01*0.24±0.01*0.19±0.01*0.0030%0.54±0.02*◇0.47±0.01*◇0.56±0.01*◇0.0015%0.59±0.01*◇0.64±0.02*◇0.59±0.01◇M1990.63±0.01*0.64±0.01*0.59±0.05*PBS0.11±0.00*0.11±0.00*0.11±0.00*

注：*濃度≥0.003%PAA同一時(shí)段相鄰各濃度組間比較，P<0.05；

◇濃度≤0.003%PAA同一濃度不同時(shí)間的組間比較，P>0.05

表3PAA處理前后血管材料的羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果

樣品羥脯氨酸含量(μg/mg)正常血管組2.01±0.16脫細(xì)胞血管支架組2.15±0.09過(guò)氧乙酸處理脫細(xì)胞血管支架組2.13±0.12

注：血管材料的羥脯氨酸含量各組兩兩比較，P>0.05

表4PAA處理后血管材料的生物力學(xué)性能指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

樣品最終抗張強(qiáng)度/MPa縫合強(qiáng)度(N/針)正常血管4.51±1.061.58±0.06脫細(xì)胞血管支架4.42±1.251.44±0.050.1%PAA處理脫細(xì)胞血管支架4.38±1.191.38±0.08

注：血管材料的UTS以及縫合強(qiáng)度各組兩兩比較，P>0.05

足夠的初始強(qiáng)度和彈性，對(duì)于組織工程血管支架的材料來(lái)說(shuō)，是非常重要和必需的。因此，我們?cè)谘芯恐袦y(cè)試了經(jīng)PAA處理前后血管組織的強(qiáng)度和彈性，以判斷經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA的處理，作為管腔狀脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的主要生物力學(xué)指標(biāo)，是否會(huì)發(fā)生明顯的改變;體外測(cè)試的結(jié)果(UTS、縫線保留測(cè)試)也證實(shí)，PAA沒(méi)有明顯改變脫細(xì)胞血管基質(zhì)的強(qiáng)度和彈性。這一結(jié)果，同時(shí)也可以從常規(guī)組織切片的膠原纖維正常形態(tài)中得到證實(shí)。

4 結(jié)論

體外試驗(yàn)初步表明，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA處理的脫細(xì)胞血管材料，其細(xì)胞毒性、生物力學(xué)以及其自身化學(xué)成分，與未經(jīng)PAA處理前比較，差異無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此我們推斷，應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)為0.1%PAA作為組織工程血管支架制備過(guò)程中的消毒滅菌制劑或許是可行的。我們?cè)诤罄m(xù)的動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中將繼續(xù)驗(yàn)證這一推論。

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Effects of peracetic acid on the biological features of the acellular vascular scaffold

LIUBin,LIFei,ZHANGMan-jing,etal.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,Xi′anCentralHospital,Xi′an710003,China)

Objective To observe the effects of 0.1% volume fraction peracetic acid on the biological features of the acellular vascular scaffold through analyzing the biocompatibility and biomechanics of the acellular vascular scaffold treated by 0.1% volume fraction peracetic acid. Methods Femoral artery were isolated under sterile conditions from 2.0～2.5 kg rabbits (10) and treated by repeated freeze thawing for disruption of donor cells. 15 μg/ml R-Nase A and 150 μg/ml D-Nase Ⅰ concentration of nuclease were used to wash out the cell debris. Then, the scaffold was put into the solution of 0.1% volume fraction peracetic acid for 3 hours at room temperature, the acellular scaffold was evaluated by histological and ultrastructural observation, the biomechanics and cytotoxicity of the blood vessels that treated by repeated freeze thawing and ultrahigh pressure was also evaluated. Results From the histological and ultrastructural analysis, the acellular scaffold treated by 0.1% volume fraction peracetic acid has no obvious difference in tissue construction, biomechanics and cytotoxicity compared with the normal control group. Conclusion This tissue processing of disinfection by 0.1% volume fraction peracetic acid treatment has not obvious effect on the biocmpatibility and biomechanics of the acellular scaffold, and it may be a alternative of disinfector for the acellular bioscaffold preparation.

Tissue engineering blood vessels; Peracetic acid; Acellular vascular scaffold; Disinfection

710003 陜西 西安，西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院(李 菲)；昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科(夏 煒,郭樹(shù)忠,魯開(kāi)化) 第一作者：劉 賓(1978-),男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，副教授,碩士生導(dǎo)師,博士. 通信作者：魯開(kāi)化,710003,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科, 電子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

實(shí)驗(yàn)研究

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.09.020

R318

A

1673-7040(2015)09-0567-04

2015-04-23)