薛晶等

[摘要] 目的 探討萬(wàn)珂對(duì)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及線粒體的發(fā)生變化程度，探討對(duì)腦缺血起到的保護(hù)作用。 方法 將實(shí)驗(yàn)于2012年5月—2013年12月期間選用的大鼠15只隨機(jī)分為萬(wàn)珂治療組5只、假手術(shù)組5只、生理鹽水組5只。模型組馬上進(jìn)行萬(wàn)珂0.2 mg/kg尾靜脈注射，對(duì)照組注射相同量的生理鹽水，在24 h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材。免疫組化法測(cè)Cyt C、Caspase-3；神經(jīng)細(xì)胞凋亡選擇TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 假手術(shù)組凋亡細(xì)胞亦少見(jiàn)，偶見(jiàn)Cyt C、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，萬(wàn)珂組Cyt C、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞明顯減少，生理鹽水組見(jiàn)大量上述細(xì)胞，且兩組上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組與假手術(shù)組上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)對(duì)比，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 萬(wàn)珂是蛋白酶體抑制劑具有保護(hù)線粒體功能，明顯的抑制炎癥反應(yīng)高峰形成，縮小腦梗死體積，減輕細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)的作用。

[關(guān)鍵詞] 萬(wàn)珂；腦缺血再灌注；凋亡；細(xì)胞色素C

[中圖分類號(hào)] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）06（c）-0095-02

[Abstract] Objective To observe the effects of VELCADE on cell apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion and the level of mitochondrial changes and study on its protective effects to cerebral ischemia. Methods 15 laboratory rats from 2012 May to 2013 December were randomly divided into VELCADE groups and pseudo surgery group and saline group with 5 in each group. VELCADE groups received caudal vein injection of 0.2 mg/kg VELCADE and the control groups received saline injection of the same volume and experimental materials were collected after 24 h. Cyt C、Caspase-3 was detected by immunohistochemical and the neuronal apoptosis was detected by TUNEL. Results Fake surgery group apoptosis died cell also rare， occasionally Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell， VELCADE group Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell and the apoptosis died cell obviously reduced， saline group see large above cell， and two group above the data compared， differences significantly has statistics meaning， two group and fake surgery group above the data compared， differences also are has statistics meaning. Conclusion VELCADE is a proteasome inhibitor， and it has a protective function of mitochondria and can significantly inhibits the inflammatory response to peak form， reduces the volume of cerebral infarction and apoptosis， protects neural function.

[Key words] VELCADE； Cerebral ischemia-reperfusion； Apoptosis ； Cytochrome C

蛋白酶體抑制劑為新型的抗腫瘤藥物，2003年已被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤，它可通過(guò)誘導(dǎo)異常分裂的腫瘤細(xì)胞凋亡起到抗腫瘤的作用，目前國(guó)外有研究結(jié)果顯示，蛋白酶體抑制劑還可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)因子NF-κBp65、IL-1β的表達(dá)有顯著的減輕炎癥反應(yīng)的作用[1]，而腦缺血再灌注后腦局部的炎癥反應(yīng)是造成再灌注損傷的重要原因之一，故國(guó)外學(xué)者將其應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，并證實(shí)其通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)腦缺血大鼠有減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)此方面的研究。該實(shí)驗(yàn)將其用于腦缺血再灌注大鼠，已證實(shí)其可抑制細(xì)胞凋亡，減小腦梗塞體積，有很好的腦保護(hù)作用，但具體機(jī)制不祥，已知細(xì)胞凋亡途徑有三種，該類藥物是通過(guò)何種途徑抑制凋亡尚不清楚，該實(shí)驗(yàn)在2012年5月—2013年12月期間選用15只大鼠為研究對(duì)象，欲采用萬(wàn)珂對(duì)腦缺血再灌注大鼠進(jìn)行治療，觀察影響線粒體途徑的指標(biāo)，目的是進(jìn)一步探討該類藥物的腦保護(hù)作用機(jī)制，為該類藥物擴(kuò)大臨床適應(yīng)癥奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床治療開(kāi)辟新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該實(shí)驗(yàn)在2012年5月—2013年12月期間選用15只普通級(jí)健康雄性Wistar大鼠， 鼠齡（3～4）個(gè)月，體重260～280 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水對(duì)照組、萬(wàn)珂治療組每組5只。大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型采用線栓法制作，腦缺血2 h再灌注即刻給予萬(wàn)珂0.2 mg/kg尾靜脈注射，對(duì)照組以相同的生理鹽水，在腦缺血2 h再灌注24 h取材，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，經(jīng)心臟灌注固定、取材，將視交叉后腦組織2 mm層面多聚甲醛緩沖液固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)切取同一層面5張切片，切片厚5 μm，用于檢測(cè)Cyt C、Caspase-3及細(xì)胞凋亡。

1.2 檢測(cè)方法

免疫組化法檢測(cè)Cyt C、Caspase-3，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，采用顯微鏡進(jìn)行觀察，每只大鼠取5張切片選相同部位計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（400倍），選擇數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

全部資料選擇SAS 9.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

免疫組化法測(cè)Cyt C、Caspase-3與細(xì)胞凋亡：假手術(shù)組凋亡細(xì)胞亦少見(jiàn)，偶見(jiàn)Cyt C、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，萬(wàn)珂組Cyt C、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞及凋亡細(xì)胞明顯減少，生理鹽水組見(jiàn)大量上述細(xì)胞，且兩組上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組與假手術(shù)組上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3 討論

該研究充分證實(shí)腦缺血再灌注后及時(shí)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑萬(wàn)珂0.2 mg/kg具有明顯的抑制炎癥反應(yīng)高峰形成，很大程度縮小了腦梗死體積，有助于減輕細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)的作用[2]。研究顯示在腦缺血時(shí)，ATP耗竭可影響蛋白質(zhì)泛素化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且能夠抑制蛋白酶體活性，致使蛋白酶體清除氧化應(yīng)激蛋白的能力水平顯著下降，與此同時(shí)氧化應(yīng)激損害進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)蛋白酶體活性的抑制[3]，這樣的惡性循環(huán)，造成蛋白聚集及神經(jīng)元死亡。除此之外依據(jù)相關(guān)研究顯示短暫性腦缺血時(shí)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)泛素化蛋白聚集過(guò)程，線粒體膜上還會(huì)呈現(xiàn)出蛋白聚集[4]，因此萬(wàn)珂有助于蛋白聚集的程度，可以引領(lǐng)細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)生。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)以及滲透壓調(diào)節(jié)中起非常突出的作用[5]。線粒體即可出現(xiàn)功能與結(jié)構(gòu)的改變，這說(shuō)明線粒體在早期的細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有啟動(dòng)功能[6]，而細(xì)胞凋亡的早期事件是細(xì)胞色素C從線粒體釋放的過(guò)程，CytC在細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起作用是至關(guān)重要的。細(xì)胞凋亡的過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的線粒體凋亡通路在細(xì)胞生存和死亡中發(fā)生了非常重要作用，目前認(rèn)為凋亡過(guò)程的早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過(guò)線粒體途徑來(lái)完成的[7]。此項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療過(guò)程中，Cyt C的釋放明顯減少，萬(wàn)珂組（34.21±1.82），生理鹽水組（46.13±1.55），P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，線粒體凋亡通路中Caspase-3蛋白的表達(dá)亦相應(yīng)減少，萬(wàn)珂組（32.04±1.31），生理鹽水組（52.49±1.20），P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)凋亡的細(xì)胞也明顯減少，萬(wàn)珂組（33.14±2.56），生理鹽水組（52.25±4.12），P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過(guò)查證相關(guān)資料顯示[7]，此項(xiàng)研究結(jié)果與國(guó)外其他報(bào)道的研究水平相一致。該研究已證實(shí)蛋白酶體抑制劑可通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑有腦保護(hù)作用，此項(xiàng)研究結(jié)果在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。目前深入研究其與腦缺血之間的關(guān)系，可能為臨床上減輕腦缺血損傷提供新的治療方案，使萬(wàn)珂有望成為很有前景的藥物靶標(biāo)。下一步將進(jìn)一步研究線粒體結(jié)構(gòu)方面的變化，同時(shí)研究其對(duì)血腦屏障的通透情況，為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

總之，此項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療過(guò)程中，Cyt C的釋放明顯減少，線粒體凋亡通路中Caspase-3蛋白的表達(dá)亦相應(yīng)減少，同時(shí)凋亡的細(xì)胞也明顯減少，其作用機(jī)制可能主要通過(guò)減少Cyt C的釋放、減輕炎癥反應(yīng)過(guò)程，阻斷了線粒體凋亡途徑，抑制腦細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮大腦保護(hù)作用。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2015-03-21）