原韜，夏海華，于沖，沙長青，2（.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱5000；2.黑龍江省科學院，哈爾濱5000；3.哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱5000）

基因工程酵母菌株Kanr基因敲除

原韜1，3，夏海華1，于沖1，沙長青1，2
（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學院，哈爾濱150001；3.哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱150001）

前期構(gòu)建的發(fā)酵菌株釀酒酵母（Saccharom yces cerevisiae）SC18-2377在引入外源功能基因的同時引入了抗性基因kanr，抗性基因的存在對工程菌株后續(xù)應(yīng)用和產(chǎn)品生物穩(wěn)定性、安全性都有較大的影響。本研究在該菌株的基礎(chǔ)上，利用基因工程方法將外源抗性基因kanr成功敲除，獲得了一株帶有外源目的基因，無外源抗性基因的基因工程釀酒酵母菌株。

釀酒酵母；抗性基因；敲除

木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富廉價的非糧可再生資源，全世界每年通過光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維生物中超過90%的資源尚未被人類所利用［1］。傳統(tǒng)釀酒酵母能夠利用葡萄糖、甘露糖和半乳糖，但無法利用木糖［2］，國內(nèi)外研究在利用賦予釀酒酵母木糖代謝能力上進行了廣泛的研究［3-5］。本課題組在前期構(gòu)建的基因工程菌株的時候出于篩選目的引入了外源抗性基因。外源基因的存在直接影響工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)的用途，對后期在醫(yī)學、食品、環(huán)境等方面進一步應(yīng)用帶來了不便。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，利用基因工程方法將外源抗性基因成功敲除，獲得了一株帶有外源目的基因，無外源抗性基因的釀酒酵母菌株。

1　材料與方法

1.1供試菌種和質(zhì)粒

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC18-2377株為黑龍江省科學院微生物研究所前期構(gòu)建菌株；質(zhì)粒pSH 65由中國科學院青島生物能源與過程研究所提供。

1.2PCR擴增引物

Kan（F），Kan（R）xylA（F）及xylA（R），用于鑒定Kanr基因敲除結(jié)果和外源xylA基因存在，合成引物序列信息詳見表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3工具酶及試劑

Taq plus酶購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、RNA酶（DNase free）購自寶生物工程有限公司，Plasm id M iniKit購自上海華舜生物科技有限公司；Gel Extraction M iniKit購自上海華舜生物科技有限公司。

1.4培養(yǎng)基

LB液體、固體培養(yǎng)基；YEPD液體、固體培養(yǎng)基。

2　實驗方法

2.1釀酒酵母預(yù)處理

取釀酒酵母SC18-2377斜面菌種，于YEPD平板上進行三區(qū)劃線，30℃培養(yǎng)直至長出單菌落。挑取單菌落接種于10m L/50m L YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃140r/m in振蕩培養(yǎng)過夜。測定菌液的在OD600nm下的吸光值，使其稀釋至50m L時吸光值達到0.4，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h至吸光值達到0.8～1.0。

2.2pSH 65質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將OD600nm下的吸光值達到0.8～1.0的SC18菌液在無菌條件下4 500r/m in室溫離心10m in棄上清；加入40m L 1×TE溶液懸浮洗滌沉淀，4 500r/m in室溫離心10m in棄上清；加入2m L 1×LiAc/0.5×TE溶液，懸浮沉淀后，室溫放置10m in。

另取一無菌離心管，分別加入100μL經(jīng)過上述處理的酵母菌懸液，1μg純化后的pSH 65質(zhì)粒DNA，100μg變性鮭精DNA，700μL1×LiAc/40% PEG-4000/1×TE混合均勻。以未加質(zhì)粒DNA的體系作為陰性對照。30℃反應(yīng)30m in后，加入88μL DMSO原液，混合均勻，40℃水浴7m in，13 000r/m in室溫離心10s，棄上清，1×TE洗滌沉淀2次，加入50～100μL 1×TE和500μL YEPD液體培養(yǎng)基，30℃、150r/m in復(fù)蘇6h。取200μL涂布于YEPD固體平板上，30℃培養(yǎng)2～4d，待菌落生長。

2.3釀酒酵母重組子的篩選與鑒定

挑取平板上長出的菌落，在不含任何抗性的YEPD斜面上傳10世代，確定菌株的遺傳穩(wěn)定性。以構(gòu)建菌株培養(yǎng)菌液為模板，分別以xylA（F）及xylA（R），Kan（F）及Kan（R）為引物，驗證釀酒酵母SC18-2377重組子染色體上是否具有構(gòu)建的外源基因xylA和基因kanr。

3　結(jié)果與討論

3.1敲除后鑒定結(jié)果

圖1　kanr基因PCR擴增檢驗結(jié)果：1 DNA Marker D2000；2敲除Kanr基因后PCR擴增結(jié)果；3初始菌株對照PCR結(jié)果Fig.1 kanrgene PCR amplification result:1 DNAMarker D2000；2 Strain kanrgene knocked out；3 Initia lcontrolstrain PCR am plification result

挑取敲除后的菌株在不含有抗生素的斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)后，接種于YEPD液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)。以菌液為模板，分別以xylA（F）及xylA（R），Kan（F）及Kan（R）為引物，對kanr基因和xylA基因進行融合PCR擴增檢驗，敲除后菌株未獲得kanr陽性擴增，xylA基因有陽性擴增，見圖1、2。

圖2　敲除后菌株P(guān)CR擴增xylA結(jié)果：M DNAMarker D2000；1-3：敲除后菌株P(guān)CR擴增xylA基因結(jié)果Fig.2 Knockoutstrain xylA gene PCR am plification result:1 DNA Marker D2000；1-3 Knockout Strain xylA gene PCR am plification result

3.2結(jié)語

利用多種原料水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是目前世界范圍的研究熱點，在利用不同方法使初始菌株增加或減少外源基因的過程中出于篩選菌株的目的，往往會引入外源抗性基因，抗性基因的存在會為下游工作帶來多種不利影響，因此，如何有效地將外源抗性基因從工程菌株中去除就成為了一個構(gòu)建工程菌株的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，各國科學家在該領(lǐng)域做出了多種嘗試，但目前各種方法普遍存在步驟煩瑣、消除效果差、回復(fù)突變率高的不足，在今后的研究中如何能夠有效克服這些不足仍是科研工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。

［1］鐘桂芳，傅秀輝，孫君桂，等.發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精的研究進展及其應(yīng)用前景［J］.微生物學雜志，2004，24（1）：42-45.

［2］BARNETT JA.The utilization of sugars by yeasts［J］.Adv Car-bohydr Chem Biochem，1976，（32）：125-234.

［3］TOIVARIMH，ARISTIDOU A，RUOHONEN L，PENTTILA M.Con-version of xylose to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae:importance of xylulokinase（XKS1）and oxygenavailability［J］.Metab Eng，2001，（03）：236-249.

［4］SEDLAK M，HO NW.Production of ethanol from cellulosic biomasshydrolysates using genetically engineered Saccharomy-ces yeast capab le of cofermenting glucose and xylose［J］.Appl Biochem Biotechnol，2004，（113-116）：403-416.

［5］SEDLAK M，HONW.Characterization of the effectivenessof hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinantSaccharomyces yeast［J］.Yeast，2004，（21）：671-684.

Genetically KanrKnockout in Engineered Yeast Strain

YUAN Tao1，3，XIAHai-huan1，YUCong1，SHAChang-qing1，2
（1.InstituteofMicrobiology，HeilongjiangAcademy of Sciences，Harbin150010，China 2.Heilongjiang Academy ofSciences，Harbin 150001，China 3.Harbin InstituteofTechnology，Harbin 150090，China）

Pre-built fermentation strain Saccharomyces cerevisiae SC18-2377 was introduced exogenous functional genemeanwhile resistance genes kanrwas added to the strains as a selectmarker.The presence of resistance genes in strains hasmore negative impact on engineered strains product's stability and security.In this study，genetic engineeringmethodsw ere used to knockoutexogenous kanr.Strainswith exogenous functionalgene noexternal resistanceexogenouswasobtained.

Saccharomyces cerevisiae；Resistancegenes；Knockout

Q78

A

1674-8646（2015）05-0004-02

2015-03-27

黑龍江省科學院科學研究基金項目資助（KY13BYTV10）

原韜（1979-），男，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，在讀博士，從事微生物學研究。

沙長青（1965-），男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究，e-mail：shachangqing@163.com