王志惠, 譚玉靜, 楊雪霞, 趙曙輝

(1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620;2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院, 上海 200040)

純棉織物上黑曲霉胞內(nèi)ATP提取方法探索

王志惠1, 譚玉靜2, 楊雪霞1, 趙曙輝1

(1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620;2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院, 上海 200040)

細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)的有效提取是利用ATP發(fā)光法檢測(cè)微生物數(shù)量的關(guān)鍵.為判斷霉菌在織物上的生長(zhǎng)情況, 以純棉織物上接種的黑曲霉為對(duì)象, 研究了霉菌胞內(nèi)ATP的提取方法，對(duì)比了加熱煮沸法、磷酸鹽緩沖液法、三氯乙酸法、二甲基亞砜法和苯扎溴銨(BAC)法共5種ATP提取方法對(duì)黑曲霉胞內(nèi)ATP的提取效率.研究結(jié)果表明， BAC法提取ATP效果最好；BAC法提取的適宜條件：BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%, pH值為12.0, 提取時(shí)間為5 min.相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)法, 通過測(cè)定ATP含量判斷織物上霉菌生長(zhǎng)的方法使檢測(cè)效率顯著提高.

純棉織物； 黑曲霉； 三磷酸腺苷(ATP)； 生物發(fā)光法； 提取條件

近年來, 國(guó)內(nèi)織物防霉整理技術(shù)發(fā)展迅速, 建立快速準(zhǔn)確的紡織品防霉性能檢測(cè)評(píng)價(jià)方法很有必要.現(xiàn)行的紡織品防霉性能評(píng)價(jià)方法主要是依據(jù)接種霉菌在試樣表面的生長(zhǎng)情況來評(píng)價(jià), 培養(yǎng)時(shí)間為28 d, 培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)霉菌生長(zhǎng)面積進(jìn)行分級(jí).該方法不僅周期長(zhǎng), 而且霉菌生長(zhǎng)程度及生長(zhǎng)面積很難準(zhǔn)確判斷, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的偏差[1].因此, 探索一種快速準(zhǔn)確的織物防霉性能檢測(cè)方法是非常必要的.

三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP) 是自然界各種生命活動(dòng)中通用的能量載體, 是活細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)指標(biāo), ATP的含量直接反映了細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞代謝活力.ATP生物發(fā)光法是近年來開發(fā)出的一種通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量來反映微生物的生長(zhǎng)情況或數(shù)量的方法.該方法的原理: 熒光素作為可被氧化的底物, 在鎂離子存在的條件下, 與熒光素酶和ATP結(jié)合形成熒光素酶-熒光素-單磷酸腺苷(AMP)的復(fù)合物, 該復(fù)合物再與氧結(jié)合發(fā)出熒光[2-3].用方程式表達(dá)如下:

蟲熒光素+AMP +CO2+光能

在一定濃度范圍內(nèi), ATP的濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系[4].ATP生物發(fā)光法具有簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境等領(lǐng)域的微生物檢測(cè)[4].目前國(guó)外已將ATP生物發(fā)光法用于抗菌織物抗菌效果的評(píng)價(jià)[5], 我國(guó)尚未建立利用ATP發(fā)光法進(jìn)行紡織品防霉整理的檢測(cè)方法.

利用細(xì)胞內(nèi)ATP含量進(jìn)行微生物檢測(cè)時(shí), 細(xì)胞內(nèi)ATP的提取是關(guān)鍵.自ATP生物發(fā)光法應(yīng)用于微生物檢測(cè)以來, 人們對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)ATP提取方法進(jìn)行了較多的探索，目前主要集中在細(xì)菌細(xì)胞, 對(duì)從霉菌細(xì)胞內(nèi)提取ATP的方法研究較少.由于霉菌和細(xì)菌在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成結(jié)構(gòu)上差別較大, 有必要探索針對(duì)霉菌細(xì)胞內(nèi)ATP的提取方法.據(jù)報(bào)道, 加熱煮沸法、磷酸鹽(PBS)緩沖液法[6]、二甲基亞砜(DMSO)法[7]、三氯乙酸(TCA)法和苯扎溴銨(BAC)法[8]均已應(yīng)用于細(xì)菌ATP提取中.本文以在棉織物上接種的黑曲霉為對(duì)象, 選用上述5種方法評(píng)價(jià)ATP的提取效果, 為建立織物的防霉檢測(cè)方法提供參考.

1　材料與方法

1.1材料及儀器

材料: 黑曲霉ATCC-6275,美國(guó)菌種保藏中心;國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物(棉GB/T 7568.2—2008),上海市紡織工業(yè)技術(shù)監(jiān)督所；ATP生物發(fā)光試劑盒(含ATP標(biāo)準(zhǔn)品),蓋寧生物科技(北京)有限公司.

儀器：ATP快速檢測(cè)儀,北京濱松光子技術(shù)股份有限公司.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1試劑配制

(1) 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(TE緩沖液):分別用去離子水配制10 mmol/L的Tris-HCl溶液和1 mmol/ L的EDTA, 調(diào)節(jié)pH值為8后等體積混合,121 ℃滅菌20 min.

(2) 沙氏液體培養(yǎng)基(SDB培養(yǎng)基):10 g/L胰蛋白胨, 20～40 g/L葡萄糖, pH值為5.6±0.2, 121 ℃滅菌20 min.

(3) PBS緩沖溶液:稱取2.84 g磷酸氫二鈉與1.36 g磷酸二氫鉀,配制成1 L溶液, 并調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4,121 ℃滅菌20 min.

1.2.2孢子懸液的制備

接種黑曲霉的斜面培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)出, 加入5～8 mL無菌生理鹽水, 用接種環(huán)刮取斜面上的孢子, 洗出的孢子液倒入裝有玻璃珠的三角瓶中.充分振蕩三角瓶將孢子分散,用滅菌的濾紙過濾后得到孢子懸液.用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子數(shù)量,稀釋孢子懸液使孢子含量為1×106～5×106個(gè)/mL.

1.2.3紡織樣品的準(zhǔn)備及接種

稱取(0.20±0.02) g的純棉織物, 并剪成適當(dāng)大小置于30 mL樣品瓶中滅菌, 防止其他霉菌或細(xì)菌的生長(zhǎng).

將黑曲霉孢子懸液用SDB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度后, 吸取0.2 mL均勻接種于樣品瓶中的布樣上, 蓋好瓶蓋,在(25±2) ℃下培養(yǎng)(48±2) h.

1.2.4ATP提取方法

(1) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL于100 ℃下預(yù)熱的生理鹽水,混合均勻后加熱煮沸3 min, 冰浴降溫至室溫.

(2) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL的PBS緩沖溶液,混合均勻后加熱煮沸3 min, 冰浴降溫至室溫.

(3) 樣品瓶中先加入2.3 mL生理鹽水,再加入2.5 mL在100 ℃下預(yù)熱的90%的DMSO,混合均勻后加熱煮沸1 min, 冰浴降溫至室溫.

(4) 樣品瓶中先加入0.8 mL生理鹽水,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的TCA溶液1 mL,置于漩渦振蕩儀上振蕩3 min, 加入3 mL的TE緩沖液稀釋.

(5) 樣品瓶中先加入0.8 mL生理鹽水,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的BAC溶液1 mL,置于漩渦振蕩儀上振蕩3 min, 加入3 mL的TE緩沖液稀釋.

1.2.5提取劑溶液pH值的優(yōu)化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的BAC溶液, 用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0以及13.1, 并按照BAC法提取黑曲霉ATP.

1.2.6提取劑濃度的優(yōu)化

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%, 0.05%, 0.20%, 0.30%, 0.40%, 0.50%, 0.60%, 0.70%和0.90%的BAC溶液,調(diào)節(jié)pH值為12±0.1, 按照BAC法進(jìn)行黑曲霉ATP的提取.

1.2.7提取時(shí)間的優(yōu)化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的BAC溶液,調(diào)節(jié)pH值為12±0.1.向培養(yǎng)好的樣品中加入0.8 mL生理鹽水和1 mL的BAC溶液后, 分別在漩渦振蕩儀上振蕩0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 min, 加入TE緩沖液稀釋.

1.2.8黑曲霉ATP發(fā)光值的測(cè)定

2　結(jié)果與討論

2.1提取方法對(duì)ATP提取效果的影響

因不同微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的成分不同, 其胞內(nèi)ATP的最適提取方法也不同.實(shí)驗(yàn)采用5種方法提取純棉織物上生長(zhǎng)的黑曲霉細(xì)胞內(nèi)的ATP, 黑曲霉的接種濃度設(shè)為3個(gè)梯度, 孢子含量分別為1×105, 1×106和1×107個(gè)/mL, 探尋黑曲霉胞內(nèi)ATP的適宜提取方法.所得ATP含量通過ATP發(fā)光法測(cè)量的發(fā)光值來判斷, 以橫坐標(biāo)為孢子含量的對(duì)數(shù)值, 縱坐標(biāo)為ATP發(fā)光平均值(U)的對(duì)數(shù)值作圖, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.從圖1可看出, 3種孢子接種濃度下, 加熱煮沸法提取ATP的效率均為最低.加熱煮沸法提取ATP的原理是利用高溫的作用將細(xì)胞破碎,同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)的ATP水解酶失活[6,9],由于加熱破壁效果有限,導(dǎo)致提取ATP效果最差.DMSO法與PBS緩沖液法提取ATP效果相近.DMSO對(duì)黑曲霉細(xì)胞有破壞作用, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后釋放出ATP[7].PBS緩沖液法的提取原理與加熱煮沸法相似, 其通過緩沖體系的作用, 改變細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的通透性, 因而提取效率有所提高.TCA法及BAC法目前廣泛應(yīng)用于細(xì)菌ATP的提取,在本實(shí)驗(yàn)中相對(duì)其他3種方法, 這兩種方法的提取效率也較高.TCA對(duì)活細(xì)胞有兩種作用：一是使細(xì)胞膜破裂從而釋放出ATP, 二是使ATP水解酶失活.由于TCA對(duì)發(fā)光反應(yīng)體系中的熒光素酶活性具有一定抑制作用,因此檢測(cè)時(shí)需要進(jìn)行大量的稀釋, 從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響[8,10].BAC作為季銨鹽表面活性劑的代表, 化學(xué)結(jié)構(gòu)為

BAC分子中既有親水基團(tuán), 又有疏水基團(tuán), 在水中帶正電荷, 而黑曲霉細(xì)胞帶負(fù)電荷, 故BAC能夠吸附聚集在黑曲霉細(xì)胞表面,進(jìn)而滲入細(xì)胞的內(nèi)脂層和蛋白層,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶鈍化, 蛋白質(zhì)變性聚集, 通透性改變, 微生物的代謝遭到破壞, 細(xì)胞內(nèi)容物滲出, ATP隨之釋放.另外BAC的存在也有助于將黑曲霉孢子從布樣上清洗下來,使得提取的黑曲霉ATP含量增加, 因而發(fā)光值提高[11-12].從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, TCA法和BAC法都適用于黑曲霉胞內(nèi)ATP的提取.由于TCA法對(duì)熒光素酶的抑制作用,因而主要研究BAC法提取ATP的適宜條件.

圖1　提取方法對(duì)ATP提取的影響Fig.1　The effect of extract methods on ATP extraction

2.2pH值對(duì)BAC法提取ATP效果的影響

提取劑的pH值不僅影響黑曲霉細(xì)胞的結(jié)構(gòu), 而且影響ATP發(fā)光系統(tǒng), 不同pH值下黑曲霉ATP的提取結(jié)果如表1所示.

表1　pH值對(duì)ATP提取的影響Table 1　Effect of pH value on ATP extraction

由表1可知, 在酸性條件下, 隨著提取液pH值的增大, ATP發(fā)光平均值逐漸增大, 當(dāng)pH值達(dá)到4.0時(shí), ATP發(fā)光平均值達(dá)到最大；pH值繼續(xù)提高, ATP發(fā)光平均值開始下降.當(dāng)pH值大于7.0后, 隨著堿性的增強(qiáng), ATP發(fā)光平均值逐漸增大, 當(dāng)pH值為12.0時(shí), ATP發(fā)光平均值達(dá)到最大值, 之后發(fā)光平均值開始下降.相對(duì)于pH值為4.0的酸性提取條件, pH值為12.0時(shí)ATP的發(fā)光平均值更高.采用BAC法提取ATP時(shí),當(dāng)酸性或堿性過強(qiáng)時(shí), ATP發(fā)光平均值過低, pH值為13.1時(shí), ATP發(fā)光平均值迅速下降到100以下.這一方面是由于極端的酸堿環(huán)境使ATP結(jié)構(gòu)破壞,另一方面,過酸或過堿的條件會(huì)導(dǎo)致熒光素酶活性喪失[13].當(dāng)提取液pH值偏中性時(shí), 提取劑對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞能力較小,使得ATP的提取效率較低,導(dǎo)致測(cè)得的發(fā)光平均值過低.因而pH值會(huì)顯著影響ATP的提取效果, BAC提取黑曲霉ATP的最佳pH值為12.0.

文獻(xiàn)[12]用兩種濃度的BAC進(jìn)行研究, 確定了大腸桿菌ATP提取的最佳pH值為5.2.文獻(xiàn)[14]研究發(fā)現(xiàn)水體中微生物ATP的最佳提取pH值為7.7～8.0.由此表明, 不同菌種ATP提取的最佳pH值相差較大, 主要是由于不同微生物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的組成不同.

2.3BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ATP提取效果的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,采用BAC法對(duì)細(xì)菌ATP提取的最佳BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.05%到0.20%不等[12,15].為了得到BAC法提取黑曲霉時(shí)所用的最佳BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù), 測(cè)試了不同濃度BAC溶液在pH值為12.0、提取時(shí)間為3 min時(shí)的提取效果,結(jié)果如圖2所示.由圖2可看出, BAC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ATP的提取有很大影響, 在BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.40%時(shí), 隨著BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大, 發(fā)光值也逐漸增大；當(dāng)BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%時(shí), ATP發(fā)光值達(dá)到最高, 之后便開始顯著下降.BAC屬于陽離子型表面活性劑, 能夠作用于黑曲霉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜, 使其通透性改變并釋放出ATP.另外, BAC的存在也有助于將黑曲霉孢子從布樣上清洗下來, 使得提取的黑曲霉ATP含量增加,因而發(fā)光值提高.當(dāng)BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)也會(huì)影響熒光素酶的活性,從而導(dǎo)致發(fā)光值降低.因此, BAC法提取黑曲霉ATP的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%.

圖2　BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ATP提取效果的影響Fig.2　The effect of mass fraction of BAC on ATP extraction

2.4提取時(shí)間對(duì)BAC法提取效果的影響

在ATP提取中, 提取時(shí)間短,則細(xì)胞內(nèi)ATP提取不完全；提取時(shí)間長(zhǎng),會(huì)影響ATP分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.另外，不同菌種提取時(shí)間差異較大, 一般提取時(shí)間為2～4 min[8,12,15].設(shè)定提取時(shí)間分別為1, 3, 4, 5, 6和8 min, 采用pH值為12.0、BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的溶液進(jìn)行黑曲霉ATP提取,考察提取時(shí)間對(duì)ATP提取的影響, 結(jié)果如圖3所示.

圖3　提取時(shí)間對(duì)ATP提取效果的影響Fig.3　The effect of extraction time on ATP extraction

由圖3可看出,當(dāng)提取時(shí)間為5 min時(shí), 發(fā)光值達(dá)到最大.當(dāng)發(fā)光值達(dá)到最大后,黑曲霉的ATP已經(jīng)全部釋放,時(shí)間延長(zhǎng),ATP發(fā)光值反而降低.因此, BAC提取黑曲霉ATP的最佳時(shí)間為5 min.

3　結(jié)　語

本文選用5種方法用于棉織物上黑曲霉胞內(nèi)ATP的提取,發(fā)現(xiàn)BAC法是最適宜的提取方法,該法提取ATP的最佳條件:BAC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%, 提取液pH值為12.0, 提取時(shí)間為5 min.相比于現(xiàn)行的紡織品防霉檢測(cè)所采用的觀察霉菌在布樣表面生長(zhǎng)覆蓋面積來判斷霉菌生長(zhǎng)情況的方法, 本文的檢測(cè)方法一方面可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間(常規(guī)法需要接種培養(yǎng)28 d后觀察布樣上的霉菌生長(zhǎng)面積, 而ATP發(fā)光法在接種培養(yǎng)2 d后即可立即測(cè)量)，另一方面，能夠進(jìn)行定量測(cè)試, 提高測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度.

采用BAC法進(jìn)行黑曲霉胞內(nèi)ATP提取與其他提取方法相比, 其效率較高、操作簡(jiǎn)便, 且對(duì)熒光素酶活性的影響較小.但ATP的提取過程中熒光素酶的活性易受pH值、鹽度以及金屬離子(如K+、 Mg2+、 Ca2+等)影響, 因而在實(shí)際提取中需要進(jìn)行探索并注意操作, 防止上述因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響.

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Extraction Methods of Intracellular ATP inAspergillusnigeron Cotton Fabric

WANGZhi-hui1,TANYu-jing2,YANGXue-xia1,ZHAOShu-hui1

(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology,Donghua University, Shanghai 201620, China;2. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200040, China)

Extraction of intracellular adenosine triphosphate(ATP)is the key of detecting the amount of microorganisms by ATP luminescence. In order to determine the growth of filamentous fungi on pure cotton fabric,Aspergillusnigerinoculated on the cotton fabric was chosen as the experimental mode to study the ATP extraction methods. Five ATP extraction methods were compared, including boiling method, phosphate buffer method, trichloroacetic acid method, dimethyl sulfoxide method and benzalkonium chloride (BAC)method. The results showed that BAC method was the best method among five extraction methods and optimal conditions included 0.50%(mass fraction) BAC, pH value 12.0 and 5 min extraction time. Compared to the traditional detection method, the testing efficiency by determining the amount of ATP to determine the growth of filamentous fungi was significantly increased.

cotton fabric；Aspergillusniger； adenosine triphosphate(ATP)；bioluminescent method；extraction condition

1671-0444(2015)03-0324-05

2014-10-10

上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研資助項(xiàng)目(2013-22)

王志惠(1990—)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向?yàn)榧徔椘房拐婢鷻z測(cè)方法.E-mail:wangzhihui200803@163.com

譚玉靜(聯(lián)系人)，女，高級(jí)工程師，E-mail:xiaotan98@126.com

TS 117

A