索艷榮，曾文赟，王一婧，李虎虎，郭茂娟，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

調(diào)肝導(dǎo)濁方對apoE-/-小鼠血脂及主動(dòng)脈斑塊面積的影響*

索艷榮，曾文赟，王一婧，李虎虎，郭茂娟，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］觀察調(diào)肝導(dǎo)濁方對apoE-/-小鼠血脂及主動(dòng)脈斑塊的影響。［方法］將apoE-/-小鼠隨機(jī)分成模型組和調(diào)肝導(dǎo)濁組并予以高脂飲食12周，C57BL/6L小鼠作為對照組給予普通飲食，12周后，檢測各組小鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的水平；油紅O染色評估主動(dòng)脈斑塊的范圍；小動(dòng)物超聲儀檢測主動(dòng)脈的斑塊面積及狹窄程度。［結(jié)果］模型組與對照組相比，TC、TG、HDL-C、LDL-C均升高（P＜0.05或P＜0.01）；調(diào)肝導(dǎo)濁組與模型組相比，LDL-C水平降低（P＜0.05），TC、TG、HDL-C無明顯差異。油紅O染色顯示模型組的斑塊范圍最大，其次是調(diào)肝導(dǎo)濁組，最后是對照組。B超結(jié)果顯示與對照組相比，模型組主動(dòng)脈的斑塊面積及狹窄程度明顯增大（P＜0.01）；調(diào)肝導(dǎo)濁方干預(yù)后，斑塊面積減?。≒＜0.05），狹窄程度明顯減輕（P＜0.01）。［結(jié)論］調(diào)肝導(dǎo)濁方可以降低apoE-/-小鼠的血清LDL-C水平，減少主動(dòng)脈的斑塊面積，并改善血管的狹窄程度。

動(dòng)脈粥樣硬化；apoE-/-小鼠；調(diào)肝導(dǎo)濁方；血脂；斑塊

近年來，心腦血管疾病的發(fā)病率在全球逐年上升，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是引發(fā)心腦血管疾病的最常見原因，對AS發(fā)病機(jī)制及防治措施的相關(guān)研究已成為全球研究的熱點(diǎn)。目前，脂質(zhì)浸潤學(xué)說是較為公認(rèn)的導(dǎo)致AS發(fā)病的假說之一，所以AS動(dòng)物模型多采用高脂飼料喂養(yǎng)。此外，在動(dòng)物模型的選擇上發(fā)現(xiàn)apoE-/-小鼠的AS發(fā)病過程與人類極其相似，故apoE-/-小鼠成為研究AS最為理想的模型。調(diào)肝導(dǎo)濁方為張伯禮教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，其由制何首烏、草決明、柴胡、茺蔚子、丹參、蒲黃、姜黃、澤瀉組成。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)肝導(dǎo)濁方對AS具有顯著成效［1-2］。本研究采用apoE-/-小鼠觀察調(diào)肝導(dǎo)濁方對AS血脂及主動(dòng)脈斑塊面積的影響。

1　材料和方法

1.1主要材料總膽固醇（TC）測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白（LDL-C）測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；油紅O染料（Solarbio）；甲醛、異丙醇溶液（天津市雙吉有限公司）；中藥材（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房）；體式顯微鏡（德國Leica設(shè)備有限公司）；C5060-ADU照相機(jī)、全自動(dòng)生化分析儀（日本OLYMPUS公司）；VEVO2100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大Visualsonics公司）。

1.2動(dòng)物分組及給藥雄性apoE-/-小鼠12只，8～9周齡，體質(zhì)量（20±2）g［南京大學(xué)國家基因工程動(dòng)物資源庫提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2010-0001］，飼養(yǎng)于天津市血液病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。apoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組和調(diào)肝導(dǎo)濁組（n=6）。同遺傳背景的8～9周齡，體質(zhì)量（20±2）g的雄性C57BL/6L小鼠［北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004］作為對照組（n=6）。模型組和調(diào)肝導(dǎo)濁組高脂飲食（1%膽固醇+10%豬油+普通飼料），對照組普通飲食12周，自由飲水。同時(shí)，調(diào)肝導(dǎo)濁組給予調(diào)肝導(dǎo)濁方（煎煮成湯汁后濃縮成含生藥1 000 g/L）灌胃20 mL/（kg·d），模型組和對照組給予等量生理鹽水。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1主動(dòng)脈血管超聲檢測各組小鼠灌胃12周后，1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，胸部備皮，采用VEVO2100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)，30 MHz進(jìn)行超聲檢查。主動(dòng)脈的內(nèi)徑、斑塊內(nèi)徑及斑塊面積采用超聲圖像分析軟件對所獲二維圖像切面進(jìn)行手動(dòng)勾畫并標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算測量結(jié)果。

1.3.2血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的檢測超聲檢查結(jié)束后，各組小鼠經(jīng)目內(nèi)眥取血至死。3000r/min離心15 min后取血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｑ錞C采用COD-PAP法，TG采用GPO-PAP法，HDL-C采用磷鎢酸-鎂沉淀法，LDL-C采用聚乙烯硫酸沉淀法。具體操作步驟參考說明書。

1.3.3油紅O染色解剖小鼠剪取完整主動(dòng)脈，并以冰凍生理鹽水沖洗，于體式鏡下，快速剝離主動(dòng)脈外膜，縱向剖開平鋪后，置于4%多聚甲醛固定備用。將平鋪后的主動(dòng)脈于油紅O染液內(nèi)浸染10 min（若存在斑塊，此區(qū)域?qū)⒈蝗境杉t色），再用60%異丙醇分化，蒸餾水沖洗1～2 min，封片固定。采用C5060-ADU照相機(jī)于體式鏡下拍照記錄。

1.3.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各組數(shù)據(jù)皆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1各組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的檢測由表1可以看出，模型組與對照組相比，TC、TG、HDL-C、LDL-C均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，調(diào)肝導(dǎo)濁組TC、TG和LDL-C有不同程度的降低，HDL-C略升高，其中LDL-C水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　調(diào)肝導(dǎo)濁方對apoE-/-小鼠血脂水平的影響Tab.1　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on serum lipids in apoE-/-mice（

表1　調(diào)肝導(dǎo)濁方對apoE-/-小鼠血脂水平的影響Tab.1　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on serum lipids in apoE-/-mice（

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）對照組模型組調(diào)肝導(dǎo)濁組LDL-C（mmol/L）3.43±1.130.92±0.262.62±0.961.94±0.80 18.78±7.22**1.26±0.40*1.72±0.78*4.07±1.08** 14.19±3.571.05±0.341.79±0.852.02±0.84##

2.2主動(dòng)脈油紅O染色見圖1。

圖1　apoE-/-小鼠主動(dòng)脈油紅O染色Fig.1　Oil red staining of apoE-/-mice artery

從圖1可以看出經(jīng)油紅O染色后，被染成紅色的斑塊主要集中在主動(dòng)脈弓分叉處及腹主動(dòng)脈以下的部位。對照組主動(dòng)脈光滑平整，可見少量紅色點(diǎn)狀脂斑散在分布；模型組主動(dòng)脈弓部見大量斑塊集中分布，面積較大，腹主動(dòng)脈區(qū)域也可見較多點(diǎn)狀斑塊；調(diào)肝導(dǎo)濁組斑塊分布與模型組相近，但主動(dòng)脈弓部斑塊面積明顯減小。

2.3主動(dòng)脈的斑塊面積及狹窄程度見圖2及表2。

圖2　主動(dòng)脈的斑塊面積及狹窄程度Fig.2　Small-animal ultrasonic imaging of apoE-/-miceartery

表2　調(diào)肝導(dǎo)濁方對apoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊的影響（x±s）Tab.2　Effects of Tiaogan Daozhuo decoction on aortic plaques in apoE-/-mice（x±s）

圖2顯示的是apoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓的超聲成像，圖中弓形的管腔即為主動(dòng)脈弓，中間低密度區(qū)為主動(dòng)脈管腔。從圖中可見對照組主動(dòng)脈管壁粗糙，內(nèi)膜稍增厚；模型組可見主動(dòng)脈斑塊形成（箭頭所指處），突向管腔，局部血管腔狹窄；調(diào)肝導(dǎo)濁組血管壁光滑，內(nèi)膜未見明顯增厚。

表2顯示各組小鼠血管內(nèi)徑基線一致，具有可比性；模型組與對照組相比，主動(dòng)脈的斑塊內(nèi)徑、面積及血管的狹窄程度明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；但經(jīng)調(diào)肝導(dǎo)濁方干預(yù)后，斑塊內(nèi)徑及面積縮?。≒＜0.05），狹窄程度明顯改善（P＜0.01）。

3　討論

在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，脂代謝紊亂扮演著重要角色。脂代謝異常是AS形成的始動(dòng)因素，并參與AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，如炎癥、內(nèi)皮損傷，平滑肌的增生和遷移、細(xì)胞凋亡等［3］。TC、TG、HDL-C和LDL-C是診斷血脂異常的常用指標(biāo)，其中LDL-C是將膽固醇運(yùn)送至全身各個(gè)組織的重要載體，但其易被活性氧自由基、金屬離子等氧化成具有毒性的oxLDL。oxLDL是AS形成的主要危險(xiǎn)因子。它可以直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，血管舒縮障礙，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂［4］。而內(nèi)皮功能紊亂是AS的始動(dòng)環(huán)節(jié)。同時(shí)oxLDL形成后，激活了免疫系統(tǒng)，募集了大量的炎細(xì)胞，分泌炎癥因子和黏附分子，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和血小板的聚集，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，使其增生、遷移，形成泡沫細(xì)胞，造成斑塊，血管腔的狹窄［5］?，F(xiàn)代研究表明oxLDL可以促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，降低線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C和細(xì)胞凋亡蛋白酶-3的表達(dá)上調(diào)，及DNA修復(fù)酶PARP的分裂而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［6］。由此可見，調(diào)整脂代謝的異常，尤其是降低LDL，抑制oxLDL的形成可有效預(yù)防AS的的發(fā)生、發(fā)展［7］。

斑塊形成后，其所處的位置直接關(guān)系到血管事件的危險(xiǎn)程度。據(jù)報(bào)道40.6%的缺血性中風(fēng)患者主動(dòng)脈處存在斑塊［8］，這些斑塊的危險(xiǎn)性遠(yuǎn)比想象的大，尤其是當(dāng)此處的斑塊厚度＞4 mm或不穩(wěn)定時(shí)，這種危險(xiǎn)性更嚴(yán)重［9］。故有效的檢測和評估動(dòng)脈粥樣硬化的程度對于血管事件的預(yù)防尤為重要。油紅O是常用的一種脂質(zhì)染料，它能將脂質(zhì)染成紅色。主動(dòng)脈經(jīng)油紅O染色后可顯現(xiàn)脂質(zhì)存在的范圍。B型超聲是臨床上常用的檢查AS的技術(shù)設(shè)備，可清晰地分辨出血管斑塊的大小及血管的狹窄程度［10］。小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)專門針對小型動(dòng)物如：大鼠、小鼠而設(shè)計(jì)，能清晰地檢測出小型動(dòng)物器官的形態(tài)及體積大?。?1］。本實(shí)驗(yàn)采用油紅O及小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)評價(jià)各組小鼠主動(dòng)脈斑塊的面積大小及血管的狹窄程度，結(jié)果顯示經(jīng)高脂飼料造模后小鼠主動(dòng)脈斑塊形成，且主要位于主動(dòng)脈弓及腹主動(dòng)脈附近，調(diào)肝導(dǎo)濁方可以減小斑塊的面積，改善血管的狹窄程度。

張伯禮教授認(rèn)為肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，氣行則血行，氣滯則血瘀。肝郁氣滯，氣不行津，津化為痰，痰濁瘀阻，久而釀生濕熱，壅塞血道，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。故可應(yīng)之以調(diào)肝導(dǎo)濁之法。調(diào)肝導(dǎo)濁方以法命名，方中姜黃破血行氣；柴胡、草決明疏肝解郁，清瀉肝火；茺蔚子、丹參清肝活血；蒲黃、澤瀉化瘀止血，滲濕利水，予邪以出路；制何首烏，補(bǔ)肝腎，益精血以防清瀉太過。現(xiàn)代研究表明姜黃、草決明、茺蔚子、澤瀉、制何首烏及其有效成分具有明顯的降脂作用［12-16］，柴胡中的有效成分柴胡皂苷具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)作用［17］，而丹參、蒲黃具有直接的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［18-19］。前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)調(diào)肝導(dǎo)濁湯可通過調(diào)脂、抗氧化，抑制平滑肌增殖等作用抗家兔及大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［20-23］。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出經(jīng)調(diào)肝導(dǎo)濁方干預(yù)后的apoE-/-小鼠血管的斑塊面積大小及血管的狹窄程度明顯小于模型組，說明調(diào)肝導(dǎo)濁方對AS具有治療作用。同時(shí)調(diào)肝導(dǎo)濁方顯著降低了apoE-/-小鼠血漿中的低密度脂蛋白水平。據(jù)此考慮調(diào)肝導(dǎo)濁方干預(yù)AS的進(jìn)程可能與其調(diào)節(jié)低密度脂蛋白的代謝有關(guān)。但這一結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（本文編輯：馬英，于春泉）

Effects of Tiaogan Daozhuo prescription on blood lipid and aorta plaque area in apoE-/-mice

SUO Yan-rong，ZENG Wen-yun，WANG Yi-jing，LI Hu-hu，GUO Mao-juan，F(xiàn)AN Ying-chang
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effect of Tiaogan Daozhuo prescription on the blood lipid and aortic plaque in apoE-/-mice.［Methods］ApoE-/-mice were randomly divided into model group and Tiaogan Daozhuo group，high fat diet for 12 weeks，C57BL/6L mice served as the control group were fed with normal diet，after 12 weeks，detection of serum TC，TG，HDL-C and LDL-C level，oil red O staining assessment aorta plaque scope；small animal ultrasound instrument to detect the aortic plaque area and degree of stenosis.［Results］TC，TG，HDL-C，LDL-C in the model group were higher than that in control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group LDL-C decreased in Tiaogan Daozhuo group（P＜0.05），and there was no significant difference of TC，TG and HDL-C.Oil red O staining showed that the range of plaque in the model group was the first，followed by the Tiaogan Daozhuo group，and the last was the control group.Compared with control group，the plaque area and stenosis of aorta in model group were significantly increased（P＜0.01），intervention by Tiaogan Daozhuo prescription.The plaque area was decreased（P＜0.05），and the degree of stenosis was significantly reduced（P＜0.01）.［Conclusion］Tiaogan Daozhuo prescription can decrease the serum levels of LDL-C in apoE-/-mice，and decrease the aortic plaque area and improve the degree of vascular stenosis.

atherosis；apoE-/-mice；Tiaogan Daozhuo prescription；blood fat；plaque

R223.11

A

1672-1519（2015）12-0739-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202797）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（08JCYBJC10800）。

索艷榮（1986-），女，博士在讀，主要從事中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的研究。

郭茂娟，E-mail：maojuanguo@foxmail.com。

（2015-06-27）