郭睿婧，付于，董樹旭，劉宇婧，趙軾軒，郝婷婷，茹永新，張思彬，顏妙璇

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193；3.中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院電鏡室，天津300020；4.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津300193）

·實驗研究·

針刺對癡呆小鼠大腦神經(jīng)元超微結構的影響*

郭睿婧1，付于2，董樹旭3，劉宇婧4，趙軾軒3，郝婷婷4，茹永新3，張思彬4，顏妙璇4

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300193；3.中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院電鏡室，天津300020；4.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津300193）

［目的］研究三焦針法對癡呆小鼠皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體結構的影響。［方法］選取雄性SAMP8小鼠30只（隨機分成模型組、非穴組、穴位組）和10只SAMR1小鼠（正常對照組）。持續(xù)治療30日后，采用電子顯微鏡對小鼠大腦皮質(zhì)頂葉和海馬CA1區(qū)進行觀察。［結果］R1組皮質(zhì)頂葉和海馬CA1區(qū)超微結構正常；SAMP8模型組小鼠神經(jīng)元部分線粒體腫大、部分變性、部分脂肪化和壞死；SAMP8三焦針刺組線粒體腫大減少，少數(shù)線粒體變性，脂肪化和壞死；非經(jīng)穴針刺組線粒體少數(shù)介于兩者之間。［結論］三焦針法能有效改善SAMP8小鼠大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)原線粒體病理性損傷。

三焦；針灸；超微結構；阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病起病隱匿、病程長、預后不良，臨床以記憶障礙、失語、失用、失認、視覺空間感知障礙、執(zhí)行功能和人格行為改變?yōu)樘卣鳎?］。AD是難治疾病，現(xiàn)代醫(yī)學無特效根治手段，大部分屬姑且或?qū)ΠY治療，包括神經(jīng)營養(yǎng)藥、膽堿酯酶抑制劑、非藥物干預及精神藥物療法，這些方法只能暫時緩解癥狀。中醫(yī)通過辨證施治，給予中藥和針灸治療，臨床報道有一定療效［2-4］。

韓景獻教授根據(jù)中醫(yī)整體觀，結合多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立“三焦針法”在臨床取得確切療效，并在實驗中得到證實［5-8］。本實驗用透射電子顯微鏡觀察三焦針法對AD模型小鼠（SAMP8）［9］海馬、皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體超微結構影響，研究三焦針法治療AD療效機制。

1　實驗方法與步驟

1.1實驗動物分組與飼養(yǎng)30只健康雄性8月齡SAMP8快速老化癡呆小鼠和10只SAMR1同品系小鼠由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院老年腦病研究室動物中心提供，采用隨機數(shù)字表法將SAMP8小鼠隨機分為模型組、非穴組和穴位組，每組10只。4組小鼠在天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院清潔級動物中心飼養(yǎng)，溫度（24±2）℃，自由采食。

1.2穴位選擇和針刺手法SAMP8穴位組采用三焦針法進行針刺，取膻中、中脘、氣海、雙側血海和雙側足三里針刺，穴位定位參照國家十五規(guī)劃教材《實驗針灸學》。針刺方法：血海穴施捻轉(zhuǎn)瀉法30 s，其余各穴分別施捻轉(zhuǎn)補法30 s；非穴位組取雙脅下兩個固定非穴位點，平補平瀉手法105s。兩組小鼠每日針刺1次，幅度均為90°～180°，頻率60～120 r/min，每個療程6 d，休息1 d后進行下1個療程，共治療4個療程。SAMR1組和模型組在同一時間用同樣方法捉抓，但不進行針刺治療。

1.3取材方法水合氯醛腹腔麻醉，小鼠停止活動后，將其仰臥固定于手術臺，剪開胸腔，暴露心臟，用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注；待小鼠耳朵變白后，用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，灌注結束后取出腦組織，分離海馬CA1區(qū)和同側頂葉皮質(zhì)［10］，各切1 mm3大小方塊，放入6%的戊二醛固定2 h。

1.4電鏡標本制備1%鋨酸后固定，蒸餾水洗兩遍，用30%、70%、90%、100%乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷過渡；然后用EPON包埋液浸透包埋，60℃烤箱聚合60 h；LeicaUC7型超薄切片機切片，厚度500 nm；醋酸鈾避光染色10 min，鉛染液染5 min，用H600電子顯微鏡觀察和拍照。

1.5檢測方法每組選3只鼠標本，每個標本在電鏡15 000倍數(shù)下選3個視野拍照。用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測量照片內(nèi)線粒體面積，計算小鼠線粒體平均面積；分析每張照片線粒體變性特點，包括空泡、脂肪滴、嵴消失、密度加深的線粒體，計算各組小鼠線粒體變性數(shù)。

1.6統(tǒng)計方法用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，正態(tài)分布計量資料組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，偏態(tài)分布的計量資料組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結構變化SAMR1組小鼠CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體呈圓形或卵圓形，外膜光滑，內(nèi)嵴清晰完整，內(nèi)腔無擴張，基質(zhì)密度均勻，無明顯腫大，見圖1A。SAMP8模型組小鼠線粒體部分形態(tài)規(guī)則，圓形或卵圓形，部分形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙不平，部分外膜溶解，呈單層膜結構，內(nèi)嵴排列紊亂或消失；部分線粒體腫大，內(nèi)腔擴張，基質(zhì)密度降低，甚至呈空泡狀改變，少數(shù)線粒體密度增高和實變，見圖1B。穴位組小鼠大部分線粒體為圓形或卵圓形，外膜呈雙層結構，少數(shù)線粒體膜破壞、溶解，線粒體嵴排列紊亂，線粒體腫大和變性少于SAMP8模型組，見圖1C。非穴組小鼠部分線粒體結構變化輕于模型組而重于穴位組，線粒體形態(tài)部分不規(guī)則，少數(shù)線粒體外膜溶解，內(nèi)嵴輕度紊亂，線粒體輕度腫脹，內(nèi)腔擴張，個別線粒體密度下降或空泡改變，見圖1D。圖像分析顯示穴位組小鼠海馬神經(jīng)元線粒體平均面積大于SAMR1組，小于模型組與非穴組，各組間比較P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；SAMR1組、針刺組神經(jīng)元變性線粒體個數(shù)少于模型組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；非穴組線粒體多于針刺組，少于模型組，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SAMR1組與針刺組之間差異，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2皮質(zhì)頂葉神經(jīng)元超微結構變化SAMR1組小鼠線所有粒體結構完整，形態(tài)規(guī)則，呈圓形和卵圓形，外膜光滑，內(nèi)嵴清晰，內(nèi)腔無擴張，基質(zhì)密度均勻，線粒體無腫大，見圖2A。模型組小鼠部分線粒體為圓形或卵圓形，部分不規(guī)則，外膜破壞、溶解，內(nèi)嵴排列紊亂；部分腫脹，內(nèi)腔擴張，密度降低，甚至形成空泡；部分線粒體密度加深，結構消失；有的線粒體脂肪化，見圖2B。穴位組小鼠線粒體外膜破壞、溶解、嵴排列紊亂、空泡現(xiàn)象和線粒體腫大程度輕于模型組，見圖2C，變性個數(shù)少于模型組；非穴位組線粒體損傷和蛻化程度介于模型組和穴位組之間，見圖2D。圖像分析顯示穴位組線粒體平均面積小于其他3組，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。神經(jīng)元線粒體變性數(shù)：SAMR1組、穴位組的均少于模型組，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；非穴位組神經(jīng)元線粒體變性數(shù)介于針刺組和模型組之間，與兩組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；針刺組多于SAMR1組，但兩組間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　各組神經(jīng)元線粒體平均面積和變性各組分析Tab.1　 Analysis of the size of the neuron mitochondrial average and the degeneration in each group（

表1　各組神經(jīng)元線粒體平均面積和變性各組分析Tab.1　 Analysis of the size of the neuron mitochondrial average and the degeneration in each group（

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別面積（μm2）變性（個）H P P H SAMR1組模型組穴位組非穴組動物數(shù)10 10 10 10 0.66±0.11 0.92±0.44 0.71±0.20 0.92±0.33 0.94±0.23 0.98±0.40 0.80±0.30 0.87±0.14 3.00±2.45* 8.33±4.32 3.33±1.15* 6.00±3.74 2.33±1.52* 7.00±1.72 3.00±1.00** 4.67±2.08

圖1　各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結構變化Fig.1　Changes of the ultrastructural of the hippocampus CA1 area neurons in each group

3　討論

隨著生活水平提高和人口老齡化，全世界AD患病率逐年增加，截至2011年美國有540萬患者，其中85歲以上人群一半受AD困擾［11-12］；中國60歲以上人群中AD患病率約1.6%，占所有失智癥患者的三分之二［13］。作為困擾老年人生命和健康嚴重疾病之一，AD引起了廣泛關注。現(xiàn)代醫(yī)學和中國傳統(tǒng)醫(yī)學對該病認識不同，中醫(yī)認為該病屬呆病、癲癥范疇，病位在腦，與上焦心肺、中焦脾胃、下焦肝腎等多個臟（腑）氣化功能異常相關，三焦氣化失常，氣血津液升降出入不暢，導致清陽不升、濁陰不降，使痰濕、瘀濁阻滯腦竅發(fā)為呆?。?4］。三焦針法立足于中醫(yī)整體觀理論，以益氣調(diào)血，扶本培元和調(diào)暢氣機為手段進行治療［15-17］。益氣可調(diào)臟腑氣化異常，調(diào)血可祛除痰濁血瘀，扶本培元使氣血生化無窮，針刺膻中、中脘、氣海可激發(fā)三焦之氣，維持上焦如霧、中焦如漚、下焦如瀆狀態(tài)；脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾為一切生痰之源，針刺中脘、足三里、血海可健脾養(yǎng)胃，生發(fā)氣血，祛痰除濕；血海行血養(yǎng)血，兩者相得益彰，清除諸邪，養(yǎng)腦清竅。

圖2　各組皮質(zhì)頂葉神經(jīng)元超微結構變化Fig.2　Changes of the ultrastructural of the parietal cortex neurons in each group

現(xiàn)代醫(yī)學將AD歸為神經(jīng)系統(tǒng)疾病，病理機制不完全清楚，主要包括如β-淀粉樣蛋白瀑布假說（the amyloid cascade hypothesis）、Tau蛋白異常、神經(jīng)血管損傷、線粒體損傷；炎性反應、氧化應激損傷，以及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白障礙等；其中線粒體功能障礙得到更多的認可。線粒體嵴為合成ATP以維持細胞正常能量需要，是細胞能量工廠，線粒體損傷可導致細胞死亡，Kristinaleuner認為線粒體功能障礙啟動了阿爾茨海默病一系列病理反應［18］。

本實驗SAMP8模型組線粒體結構損傷與國外報道相符［19-20］，是研究AD的理想動物模型。實驗結果顯示穴位或非穴位針刺小鼠的海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體嵴較模型組完整，腫脹和變性程度改善，說明兩種針刺方法均有效。其次，穴位針刺小鼠神經(jīng)元線粒體形態(tài)結構接近SAMR1組，空泡和變性少于非穴組，說明三焦針法治療效果好于其他非針刺方法。

總之，本實驗證實三焦針法能保護SAMP8小鼠大腦神經(jīng)元線粒體損傷，與筆者前期實驗結果相符［21-22］，具體治療機制有待于進一步深入研究。

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（本文編輯：馬英，于春泉）

Effects on the acupuncture method on the ultrastructure of the cerebrum of 8-month-old swift aging mice

GUO Rui-jing1，F(xiàn)U Yu2，DONG Shu-xu3，LIU Yu-jing4，ZHAO Shi-xuan3，HAO Ting-ting4，RU Yong-xin3，ZHANG Si-bin4，YAN Miao-xuan4
（1.Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300060，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Laboratory of Electron Microscopy，Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300020，China；4.Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the influence of acupuncture method of triple energizer on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of 8-month-old swift aging mice（SAMP8）.［Methods］The dementia mice were randomly divided into 3 groups: model group，acupuncture group and non-acupoint acupuncture group，and a normal group（SAMR1）group were set up.The mouse cerebral cortex and hippocampus CA1 region were observed by electron microscopy.［Results］Ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of the SAMR1 mice were almost normal.Acupuncture group had better expression on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of SAMP8 mice than that in other two groups.［Conclusion］The acupuncture method of triple energizer has protective effects on ultrastructure of the cortex and hippocampus CA1 region of SAMP8 mice.

Sanjiao；acupuncture；electron microscopy；alzheimer's disease

R749.41

A

1672-1519（2015）12-0735-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.12.09

國家自然科學基金項目（81173414）。

郭睿婧（1988-），女，碩士，中醫(yī)師，主要從事針灸抗衰老研究。

付于，E-mail：happyfu1970@163.com。

（2015-09-20）