胡祥龍，翟少東，張文佳，曹　冰，楊　軍

（1.華南師范大學(xué)激光生命科學(xué)研究所，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物光子學(xué)研究院，廣東廣州510631）

生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸的協(xié)同給藥研究*

胡祥龍，翟少東，張文佳，曹冰，楊軍

（1.華南師范大學(xué)激光生命科學(xué)研究所，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物光子學(xué)研究院，廣東廣州510631）

腫瘤單一藥物治療的效果往往不佳，且易產(chǎn)生耐藥性，因此，腫瘤的多藥協(xié)同治療具有明顯優(yōu)勢(shì)，并逐漸引起重視。本工作基于具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）兩嵌段聚合物，物理包埋兩種化療藥物，阿霉素（Doxorubicin，DOX）和喜樹堿（Camptothecin，CPT），實(shí)現(xiàn)兩種化療藥物的共傳輸、藥物釋放與協(xié)同給藥，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

聚乙二醇-嵌段-聚乳酸；生物可降解性；藥物釋放；協(xié)同給藥

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.009

0　引言

通過(guò)在傳統(tǒng)藥物系統(tǒng)中混合負(fù)載多種藥物實(shí)現(xiàn)復(fù)雜疾病的系統(tǒng)治療，相對(duì)于單一藥物治療，是一種方便，有效的手段［1，2］。近年來(lái)眾多載藥體系被用于多藥傳輸，如無(wú)機(jī)二氧化鈦納米管［3］、兩親性小分子膠束等［4］。其中，醫(yī)用高分子的載藥體系研究越來(lái)越引起關(guān)注，相對(duì)于無(wú)機(jī)材料，其具有良好的生物可降解性和生物相容性；相對(duì)于小分子表面活性劑，高分子載藥體系具有更好的穩(wěn)定性、易功能化和良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征［5-9］。聚乳酸（PLA）和聚乙二醇（PEG）分別作為合成高分子的典型代表已被廣泛用作藥物載體，其安全性已經(jīng)通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證。其中，PEG功能化PLA嵌段共聚物能夠有效地調(diào)控載體的親疏水性、藥物釋放速率和載藥率，延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間、加強(qiáng)藥物靶向給藥能力［10］；其膠束內(nèi)核可以同時(shí)負(fù)載多種疏水化療藥物，因此有望進(jìn)一步用于多藥的共傳輸與協(xié)同給藥。

本工作中，我們采用聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）為生物可降解載體，同時(shí)包埋兩種具有協(xié)同作用的抗腫瘤化療藥物阿霉素（DOX）和喜樹堿（CPT），可以很好地實(shí)現(xiàn)兩種協(xié)同化療藥物的共傳輸，表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗腫瘤活性。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑

聚乙二醇單甲醚（PEG45-OH，Mn=2.0 kDa，Mw/Mn=1.06），喜樹堿（camptothecin，CPT），阿霉素（doxorubicin hydrochloride，Dox·HCl）和辛酸亞錫等均采購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，直接使用。無(wú)水乙醚，四氫呋喃，二氯甲烷，甲苯等溶劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，甲苯使用前經(jīng)干燥蒸餾處理。

1.2儀器與表征

核磁共振譜（NMR）采用Bruker AV300核磁共振儀表征（共振頻率為300 MHz，CDCl3為氘代試劑）。透射電子顯微鏡（TEM）測(cè)試在JEOL 2010電子顯微鏡完成，加速電壓120 kV，樣品制備時(shí)，吸取10 μL樣品溶液滴在Formvar薄膜和碳膜的銅網(wǎng)上，然后快速液氮冷卻，冷凍干燥以保持其在溶液態(tài)的形貌。水相中納米粒子的尺寸采用Malvern Nano ZS表征。紫外-可見(jiàn)光譜利用Unico UV/vis 2802PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試。

2　結(jié)果與討論

2.1生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的合成

將單甲基聚乙二醇（2 g，1 mmoL）和丙交酯（7.21 g，50 mmoL）溶于50 mL干燥甲苯中，減壓除去大部分甲苯；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入催化量辛酸亞錫；再減壓抽去部分甲苯，封閉體系，在100℃下反應(yīng)12 h，用液氮終止反應(yīng)，用四氫呋喃稀釋，無(wú)水乙醚沉淀，反復(fù)溶解、沉淀三次，經(jīng)室溫干燥過(guò)夜，得到白色固體（7.8 g，產(chǎn)率為76.3%），其核磁共振氫譜表征如Fig.1所示，經(jīng)過(guò)對(duì)比計(jì)算聚乙二醇主鏈中亞甲基質(zhì)子在3.65 ppm處的積分面積與聚乳酸主鏈上的甲基質(zhì)子在1.56 ppm處的積分面積，得到PLA的聚合度為30，其分子式表示為PEG45-b-PLA30。

2.2雙藥物負(fù)載的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸膠束納米粒子的制備與表征

由于PEG45-b-PLA30中聚乙二醇親水鏈的存在，因此其具有兩親性。本文采用“自下而上”的自組裝策略來(lái)制備負(fù)載雙藥物的PEG45-b-PLA30膠束納米粒子，先分別稱取5.0 mg PEG45-b-PLA30，1 mg喜樹堿，1 mg阿霉素溶解在1.0 mL DMSO中，再加入50 μL三乙胺使阿霉素鹽酸鹽去質(zhì)子化，常溫?cái)嚢枞芙? h；隨后將其快速注入達(dá)到快速攪拌的去離子水中，持續(xù)攪拌3 h，然后轉(zhuǎn)移到透析袋中對(duì)水透析，除去有機(jī)溶劑，多次換水，即可制備包埋兩種藥物的膠束納米粒子，進(jìn)行濃度標(biāo)定，并用于后續(xù)測(cè)試。

采用粒度儀對(duì)該載藥膠束在水相中的尺寸進(jìn)行了表征，如Fig.2a所示，納米粒子的平均直徑約為53 nm，分布較窄，抗腫瘤藥物傳輸納米粒子的尺寸一般不超過(guò)200 nm會(huì)更加有利，因此，本體系中包埋兩種藥物的納米載體的尺寸滿足腫瘤治療的要求。如Fig.2b所示，采用透射電鏡（TEM）進(jìn)一步表征了該載藥膠束系統(tǒng)干態(tài)下的尺寸與分布，直徑約為42 nm，略小于水相中的尺寸，這是由于在干態(tài)下的TEM測(cè)試中，外圍的PEG親水鏈?zhǔn)菬o(wú)法辨識(shí)的，造成粒徑略小的現(xiàn)象。另外，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線法，測(cè)定了該載藥膠束系統(tǒng)對(duì)阿霉素和喜樹堿的載藥量分別達(dá)到8. 2%和10.6%。

圖1　生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30分子結(jié)構(gòu)及其核磁共振氫譜表征Fig.1　Chemical structure and 1H NMR spectrum of PEG45-b-PLA30diblock copolymer

圖2　聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30負(fù)載阿霉素和喜樹堿藥物的膠束表征：（a）流體力學(xué)尺寸（DLS）分析；（b）透射電鏡（TEM）表征Fig.2　（a）Hydrodynamic diameter distributions，＜Dh＞，and（b）TEM image recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30diblock copolymer

圖3　包埋阿霉素和喜樹堿的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸雙藥物系統(tǒng)的體外藥物釋放曲線Fig.3　DOX and CPT release profiles recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30upon incubation with PBS buffer at pH 7.4

2.3藥物釋放評(píng)價(jià)

取200 μL 0.1 g/L的載藥膠束裝入透析管中，然后將該透析管浸入磷酸鹽（PBS）緩沖液中，設(shè)定條件為pH 7.4，溫度37℃，定時(shí)取10 mL透析液測(cè)試，并補(bǔ)充等體積的新鮮緩沖液到試劑瓶中。采用紫外分光光度計(jì)定量藥物釋放的速率。如Fig.3所示，得到阿霉素和喜樹堿的體外藥物釋放曲線，在生理?xiàng)l件下孵育24 h，阿霉素和喜樹堿的累計(jì)釋放量分別達(dá)到43%和36%，因此，被包埋在膠束疏水內(nèi)核的兩種化療藥物均可以釋放出來(lái)，而且具有良好的可控性特征。

2.4抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

本工作中，我們選用HepG2細(xì)胞系，利用MTT法評(píng)價(jià)了該載藥膠束的抗腫瘤活性。首先將HepG2細(xì)胞接種到96孔板上，每個(gè)孔添加100 μL培養(yǎng)基，初始密度約為每孔80 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞貼壁，再用換取新鮮的培養(yǎng)基替代，分別加入空白膠束、小分子抗癌藥物阿霉素、喜樹堿或載藥的膠束，共培養(yǎng)48 h。另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照組和培養(yǎng)基空白組，每孔設(shè)5復(fù)孔。每孔加入20 μL MTT試劑（PBS溶液，5 mg/mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，吸出DMEM培養(yǎng)基，加入180 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的吸光度值（A）。每次實(shí)驗(yàn)條件均采集四組數(shù)據(jù)，所得到的最終數(shù)據(jù)是四組平行試驗(yàn)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD），以培養(yǎng)基空白組調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。如Fig.4a所示，PEG45-b-PLA30空白膠束具有很好的生物相容性，聚合物濃度達(dá)到300 μg/mL的情況下，其存活率仍然高于80%；另外，已有報(bào)道表明阿霉素和喜樹堿對(duì)多種腫瘤具有較好的協(xié)同抑殺作用［11，12］，本文也研究了負(fù)載有兩種藥物膠束的細(xì)胞毒性并與小分子抗癌藥物對(duì)比，如Fig.4a所示，負(fù)載有兩種藥物的膠束系統(tǒng)比單一小分子抗癌藥物具有更高的抗腫瘤活性，從而說(shuō)明本體系中的協(xié)同給藥功能具有明顯的優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

3　結(jié)論

近年來(lái)，多藥傳輸被用于抗腫瘤研究越來(lái)越受到關(guān)注，且基于生物可降解高分子的多藥協(xié)同傳輸體系更具有優(yōu)勢(shì)。本文利用具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸作為載體，同時(shí)物理負(fù)載兩種化療藥物，阿霉素和喜樹堿，制備了分布較均勻的球形納米粒子。細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)表明，該雙載藥膠束系統(tǒng)對(duì)HepG2細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了協(xié)同給藥，具有較好的抑殺效果。本文研究表明，生物可降解高分子聚乙二醇-嵌段-聚乳酸在腫瘤的多藥協(xié)同傳輸、協(xié)同給藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

圖4　（a）聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的空白膠束溶液與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h的細(xì)胞活性；（b）包埋阿霉素和喜樹堿的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸膠束溶液與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)Fig.4　Cell viability determined by MTT assay for HepG2 cells upon incubation 48 h with aqueous dispersion of（a）blank micelles of PEG45-b-PLA30diblock copolymer，and（b）CPT and DOX co-loaded polymeric micelles of PEG45-b-PLA30at varying equivalent drug concentrations

［1］ PEER D，KARP J M，HONG S，et al.Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy［J］.Nat Nanotechnol，2007，2:751-760.

［2］LIBOIRON B D，MAYER L D.Nanoscale particulate systems for multidrug delivery:towards improved combination chemotherapy［J］.Therapeutic Delivery，2014，5:149-171.

［3］AW M S，ADDAI-MENSAH J，LOSIC D.A multi-drug delivery system with sequential release using titania nanotube arrays［J］. Chem Comm，2012，48:3348-3350.

［4］SHEN Y，JIN E，ZHANG B，et al.Prodrugs forming high drug loading multifunctional nanocapsules for intracellular cancer drug delivery［J］.J Am Chem Soc，2010，132:4259-4265.

［5］HU X L，LIU S Y.Recent advances towards the fabrication and biomedical applications of responsive polymeric assemblies and nanoparticle hybrid superstructures［J］.Dalton Trans，2015， 44:3904-3922.

［6］HU X L，HU J M，TIAN J，et al.Polyprodrug amphiphiles:Hierarchical assemblies for shape-regulated cellular internalization，trafficking，and drug delivery［J］.J Am Chem Soc，2013，135:17617-17629.

［7］HU X L，LI H，LUO S Z，et al.Thiol and ph dual-responsive dynamic covalent shell cross-linked micelles for triggered release of chemotherapeutic drugs［J］.Polym Chem-Uk，2013，4:695-706.

［8］HU X L，LIU G H，LI Y，et al.Cell-penetrating hyperbranched polyprodrug amphiphiles for synergistic reductive milieu-triggered drug release and enhanced magnetic resonance signals［J］.J Am Chem Soc，2015，137:362-368.

［9］HU X L，TIAN J，LIU T，et al.Photo-triggered release of caged camptothecin prodrugs from dually responsive shell cross-linked micelles［J］.Macromolecules，2013，46:6243-6256.

［10］ VILA A，GILL H，MCCALLION O，et al.Transport of pla-peg particles across the nasal mucosa:Effect of particle size and peg coating density［J］.J Control Rel，2004，98:231-244.

［11］CAMACHO K M，KUMAR S，MENEGATTI S，et al.Synergistic antitumor activity of camptothecin-doxorubicin combinations and their conjugates with hyaluronic acid［J］.J Control Rel，DOI:10.1016/j.jconrel.2015.1004.1031.

［12］CHEN M，F(xiàn)ENG W，LIN S，et al.Antitumor efficacy of a plga composite nanofiber embedded with doxorubicin@msns and hydroxycamptothecin@hanps［J］.RSC Adv，2014，4: 53344-53351.

Synergetic Drug Treatment Based on Biodegradable Poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）Nanocarriers

HU Xianglong，ZHAI Shaodong，ZHANG Wenjia，CAO Bing，YANG Jun
（1.MOE Key Laboratory Laser Life Science&Institute of Laser Life Science，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

The therapeutic efficiency of tumors upon treating with single drug is usually unsatisfactory，which would probably result in drug resistance.Hence，the multi-drug synergetic therapy against tumors has exhibited some advantages and attracted attention gradually.In the current work，biocompatible and biodegradable poly（ethylene glycol）-b-poly（lactic acid），（PEG-b-PLA），was employed to encapsulate two types of anticancer drug，doxorubicin（DOX）and camptothecin（CPT）.It was demonstrated that dual drug delivery，release，and synergetic drug treatment was realized in the nanocarrier，exhibiting good anticancer activity.

poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）；biodegradability；drug release；synergetic drug treatment

Q225

A

1007-7146（2015）04-0354-04

2015-05-26；

2015-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51403042）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030310310）

胡祥龍（1984-），男，漢族，安徽六安人，華南師范大學(xué)講師，博士，主要從事生物醫(yī)用高分子研究。（電話）020-85211436；（電子郵箱）xlhu@scnu.edu.cn