荊瑞勇，王麗艷，郭永霞

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319）

丹參愈傷組織培養(yǎng)中激素濃度的優(yōu)化研究*

荊瑞勇，王麗艷，郭永霞*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶163319）

目的：優(yōu)化丹參愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度的最佳組合。方法：以丹參種子為外植體，以無菌苗下胚軸誘導(dǎo)的初代愈傷組織為材料，以愈傷組織凈增鮮重為指標(biāo)，利用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬，建立數(shù)學(xué)模型，利用響應(yīng)面法進(jìn)行激素濃度組合尋優(yōu)。結(jié)果：丹參愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度的最佳組合為6-BA 1.514 mg/L+NAA 2.059 mg/L+2，4-D 2.137 mg/L；愈傷組織的凈增殖鮮重為35.66 g。

丹參；響應(yīng)面法；愈傷組織；激素濃度

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.014

丹參（Saliae Miltiorrhiza Bge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物。其有效成分為丹參酮、隱丹參酮、丹參新酮、原兒茶醛、鼠尾草酚等。中藥中以其根及根莖入藥，具有去瘀生新、活血調(diào)經(jīng)、消腫止痛、鎮(zhèn)靜安神等功效，因此臨床上用于治療產(chǎn)后瘀阻腹痛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、神經(jīng)衰弱失眠等癥狀。另外丹參在人類心腦血管疾病、抗衰老、抗癌等方面具有良好的治療效果［1，2］。隨著丹參制劑在國內(nèi)外心血管藥物市場上的占有量不斷提高對丹參的需求量迅速擴(kuò)大。

中草藥藥用成分可以通過三種方式獲得:一是可用植株提?。欢墙?jīng)愈傷組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式獲得；三是經(jīng)毛狀根培養(yǎng)獲得。三種方式各有優(yōu)缺點，第一種方式是受自然資源的限制；后兩種方式是難于找到最佳的培養(yǎng)條件。本文以丹參下胚軸為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，對愈傷組織增殖的培養(yǎng)基利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，并對懸浮培養(yǎng)做了初步研究，為懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)和丹參愈傷組織的擴(kuò)大化培養(yǎng)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

丹參種子，購于河北省安國市藥材市場。

1.2試驗方法

1.2.1丹參種子的消毒方法 首先將丹參種子用清水沖干凈，然后在超凈工作臺中先用75%乙醇浸泡種子2 min，將乙醇倒出后再用0.1%升汞溶液浸泡種子15 min后倒出，最后用無菌蒸餾水沖洗5次后，備用。

1.2.2丹參初代愈傷組織的獲得 將消毒好備用的丹參種子接種于MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)芽暗培養(yǎng)。待苗長到3-5 cm高時，將其下胚軸切割成約0.5 cm長的小段放入培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D中進(jìn)行初代愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)基及試驗設(shè)計 基本培養(yǎng)基選用MS；選擇組織培養(yǎng)中最常用的三種激素6-BA（6-芐氨基嘌呤），2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），NAA（萘乙酸）為試驗因素。各因素變化區(qū)間由預(yù)試驗確定，查表確定星號臂即γ值，結(jié)果見表1。用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計安排試驗見表2。

1.2.4丹參愈傷組織最佳培養(yǎng)基的篩選 將培養(yǎng)15 d的初代愈傷組織切成大小平均為0.25 g的小塊接入表2的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶4塊，每個處理總計20塊，總質(zhì)量為5 g，即初始鮮重為5 g。接種15 d以后，將愈傷組織取出去除干凈培養(yǎng)基后進(jìn)行鮮重的稱量即為最終鮮重，以凈增鮮重（即最終鮮重-初始鮮重）為指標(biāo)進(jìn)行最佳培養(yǎng)基的篩選。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗的數(shù)據(jù)按照二次回歸方程的預(yù)測模型進(jìn)行回歸分析。分析軟件使用SAS（Statistical Analysis System）9.1，自編程序。

表1　試驗因素水平編碼表Tab.1　Coded levels of variables of the orthogonal rotary composite experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1回歸模型的建立與檢驗

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，利用SAS RSREG Procedure對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸模型如下:y=-45.

對模型（式1）進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表3）表明:此模型的決定系數(shù)R2為0.9548，回歸模型達(dá)到高度顯著水平（P＜0.0001），說明此模型能夠95.48%的模擬實際情況。逐項顯著性檢驗結(jié)果表明，線性項和二次項對試驗結(jié)果均有極顯著性影響，其決定系數(shù)分別為0.3676和0.5849。而互作項對試驗結(jié)果無顯著性影響，其決定系數(shù)僅為0.0023。對模型失擬進(jìn)行顯著性檢測，結(jié)果P=0.2079＞0.05，不顯著，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結(jié)果［5］。

對回歸模型各系數(shù)的顯著性分析，結(jié)果（表4）表明:各互作項的系數(shù)顯著性大于0.05，其余各項均小于0.05，因此優(yōu)化后得到的模型為:y=-45.176

2.2培養(yǎng)基激素濃度組合尋優(yōu)

利用RSREG Procedure進(jìn)行典型分析，得到一個穩(wěn)定點見表5:6-BA（x1）為1.169 mg/L、NAA（x2）為1.118 mg/L、2，4-D（x3）為1.130 mg/L，并判斷該點為最大值點，其愈傷組織凈增鮮重（y）為35. 66 g。

以MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L +2，4-D 1.130 mg/L為培養(yǎng)基，接種愈傷組織，接種5瓶，每瓶4塊，總計20塊，總質(zhì)量為5 g，重復(fù)試驗3次，培養(yǎng)15 d后稱取愈傷組織凈增鮮重分別為34.45 g、34.05 g、36.85 g平均為35.12 g，略低于預(yù)測值，但差值小于5%。因此可將6-BA（x1）為1.169 mg/L、NAA（x2）為1.118 mg/L、2，4-D（x3）為1.130 mg/L作為增殖培養(yǎng)基激素的最佳濃度組合。應(yīng)用丹參愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基MS +6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，培養(yǎng)出的愈傷組織較疏松，為黃綠色（圖1）。

表2　正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計方案及結(jié)果Tab.2　Quadratic orthogonal rotary composite experimental design and experimental result

表3　二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Tab.3　Analysis of variance（ANOVA）of the regression model of quadratic response

表4　回歸模型系數(shù)的顯著性分析Tab.4　Analysis of variance for regression model

表5　典形分析（穩(wěn)定點、特征值和特征向量表）Tab.5　Canonical analysis of response surface based on coded data（stationary point，eigenvalues and eigenvectors）

圖1　最佳培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織Fig.1　Callus induced under optimized culture condition

2.4丹參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

將在篩選出的最佳培養(yǎng)基上生長的愈傷組織接種到不加瓊脂的液體培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.169 mg/L +NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L中進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在此培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞生長良好，培養(yǎng)周期為15 d，懸浮細(xì)胞團(tuán)為淡黃褐色，最大的細(xì)胞團(tuán)如黃豆粒般大?。▓D2）。

3　小結(jié)與討論

通過數(shù)學(xué)模擬得到的模型為:y=-45.176+17. 705·x1+79.102·x2+46.496·x3-7.578·x12-34.185· x22-20.785·x32。通過模擬尋優(yōu)得到的丹參愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為:MS+6-BA 1.169 mg/L+ NAA 1.118 mg/L+2，4-D 1.130 mg/L，其愈傷組織凈增鮮重y為35.66 g。

影響植物組織培養(yǎng)成功的因素有很多，其中最主要的是激素的種類和濃度。在植物組織培養(yǎng)激素優(yōu)化的過程中可利用多種試驗設(shè)計，其中采用完全隨機(jī)試驗設(shè)計的比較多，在旱半夏繼代增殖培養(yǎng)基的篩選過程中就利用了完全隨機(jī)試驗設(shè)計方法［3］；在薺菜芽分化增殖最適培養(yǎng)基的篩選中也利用了此設(shè)計方法［4］。但此種設(shè)計方法不適用于試驗因素和水平較多的試驗，因處理太多而導(dǎo)致工作量過大。采用正交試驗設(shè)計的也很多，如在丹參愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基優(yōu)化的過程中［5］。在山豆根組織培養(yǎng)激素優(yōu)化過程中［6］。但這種方法同樣需要重復(fù)試驗，得到的結(jié)論也都是設(shè)計好的一些因素的點的組合，相對來說還是不夠精確。而本試驗中采用的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計具有試驗次數(shù)少、計算簡便，并且能根據(jù)預(yù)測值直接尋求最優(yōu)區(qū)域的優(yōu)點，因此得到結(jié)果更加精確。利用這種設(shè)計方法進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化的也有相關(guān)的報道，如在甘草［7］、大豆［8］愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中。本試驗通過響應(yīng)面優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.169 mg/L+NAA 1.118 mg/L+2，4-D1.130 mg/L，與柳福智［9］的研究結(jié)果NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L相近，但較其更為精確。

圖2　懸浮細(xì)胞Fig.2　Suspension cells

［1］ 徐任生.丹參-生物學(xué)及應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，1990: 158-184. XU Rensheng.Biology and Application of Saliae Miltiorrhiza Bge［M］.Beijing:Science Press，1990:158-184.

［2］LIU Jin，SHEN Hanming，ONG CHOON-NAM.Salvia Miltiorrhiza inhibits cell growth and induces Apoptosis in human Hepatoma Hepatoma HepG2 cells［J］.Canc Lett，2000，153（1-2）:85-93.

［3］王麗艷，荊瑞勇，譚煥波，等.旱半夏組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）:1795-1796. WANG Liyan，JING Ruiyong，TAN Huanbo，et al.Optimization of tissue culture condition on Pinellia tenata（Thumb）Breit［J］. LISHIZHEN Medicine and Material Mediaca Research，2008，19（7）:1795-1796.

［4］王麗艷，荊瑞勇，郭培磊.薺菜無菌快速繁殖技術(shù)的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2007，19（3）:13-16. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Peilei.Study on rapid propagation technology of Capsella bursa-pastoris［J］.Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University，2007，19（3）:13-16.

［5］客紹英，石洪凌，馬作東，等.利用正交試驗優(yōu)化丹參愈傷組織培養(yǎng)［J］.中藥材，2005，28（2）:82-83. KE Shaoying，SHI Hongling，MA Zuodong，et al.Optimaization of callus tissue culture saliae miltiorrhiza bge by orthogonality design［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2005，28（2）: 82-83.

［6］李林軒，韋坤華，唐美瓊，等.正交試驗優(yōu)化山豆根組織培養(yǎng)條件［J］.中藥材，2012，35（4）:514-517. LI Linxuan，WEI Shenhua，TANG Meiqiong，et al.Optimization of tissue culture of Sophora tonkinensis Gagnep by orthogonality design［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2012，35（4）: 514-517.

［7］王麗艷，荊瑞勇，殷奎德.甘草愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度組合的優(yōu)化研究［J］.激光生物學(xué)報，2010，19（6）:848-852，842. WANG Liyan，JING Ruiyong，YIN Kuide.Optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis［J］.Acta laser Biology Sinica，2010，19（6）:848-852，842.

［8］王麗艷，荊瑞勇，郭永霞，等.大豆愈傷組織繼代培養(yǎng)中激素濃度組合的優(yōu)化研究［J］.中國油料作物學(xué)報，2013，35（4）: 446-450. WANG Liyan，JING Ruiyong，GUO Yongxia，et al.Study on optimum hormone concentration during subculture of soybean callus tissue［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciencer，2013，35（4）: 446-450.

［9］柳福智.丹參愈傷組織誘導(dǎo)與有效成分含量的研究［D］.陜西:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006. LIU Fuzhi.Induction of callus tissue of Saliae miltiorrhiza Bge and content of effective elements［D］.Shanxi:Northwest Agriculture& Forestry University，2006.

Study on Optimization of Hormone Concentration in Callus Culture of Saliae Miltiorrhiza Bge

JING Ruiyong，WANG Liyan，GUO Yongxia*
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang，China）

Objective:To seek optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Glycyrrhiza uralensis.Methods:The seed of Saliae Miltiorrhiza Bge as explants，first generation callus induced by embryo root and hypocotyledonary axis of sterilized seed as material，the net fresh weight of callus as indicator，mathematical model were established by quadratic orthogonal rotary composite experimental design.The concentration of hormones were optimized by method of response surface.Result:The optimum combination of hormone concentration during callus subculture of Saliae Miltiorrhiza Bge is 6-BA 1.514 mg/L，NAA 2.059 mg/L，2，4-D 2.137 mg/L.The net fresh weight of callus is 35.66g.

Saliae Miltiorrhiza Bge；method of response surface；callus；hormone concentration

S567.1

A

1007-7146（2015）04-0377-05

2014-12-09；

2015-02-03

黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2012C049）

荊瑞勇（1978-），男，內(nèi)蒙人，博士后，講師，主要從事生物技術(shù)方面研究。（電話）0459-6819299-810；（電子信箱）jry_2002@126.com

郭永霞（1970-），女，黑龍江人，博導(dǎo)，教授，主要從事生物技術(shù)方面研究。（電話）+86-459-6813789；（電子信箱）gyxia@163.com