廖盧艷，張　喻

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.東方科技學(xué)院；b.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽
發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化*

廖盧艷a，b，張喻b*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.東方科技學(xué)院；b.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

以生產(chǎn)淀粉糖的副產(chǎn)物米渣為原料，采用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵法制備米渣抗氧化肽。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵產(chǎn)物的還原力為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量和料液比等因素對(duì)米渣抗氧化肽抗氧化活性的影響，對(duì)發(fā)酵制備工藝條件進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，最大還原力的發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間48 h，溫度30℃，接種量5%，料液比1∶4，此時(shí)還原力達(dá)1.907。

枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；還原力；米渣；抗氧化肽

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.012

長(zhǎng)期以來(lái)，稻米生產(chǎn)以及副產(chǎn)物的綜合利用一直受到高度關(guān)注。稻米經(jīng)生產(chǎn)加工后剩下的大量副產(chǎn)物如米渣、稻殼、米糠、碎米等，國(guó)內(nèi)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)這些大米副產(chǎn)物綜合利用的研究［1-3］。以大米為原料生產(chǎn)淀粉糖、谷氨酸、檸檬酸、乳酸及生化藥品等產(chǎn)品時(shí)，大米粉經(jīng)液化或糖化后會(huì)產(chǎn)出副產(chǎn)品--米渣，由于大量淀粉已被利用，米渣中蛋白質(zhì)得到濃縮，蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%～60%，是寶貴的蛋白質(zhì)資源。據(jù)資料顯示在大米淀粉糖的生產(chǎn)過(guò)程中每消耗7噸大米就要產(chǎn)出1噸米渣［4］。若能將這些大米蛋白資源用于大米蛋白活性肽、濃縮蛋白、分離蛋白等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用，將極大地提高米渣的附加值，帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

近年來(lái)，利用酶法制備大米抗氧化肽的研究比較多［5-6］，但利用發(fā)酵法制備米渣蛋白活性肽的研究很少，對(duì)米渣蛋白抗氧化肽的研究也鮮見(jiàn)，而對(duì)玉米和豆類(lèi)蛋白活性肽已有相當(dāng)數(shù)量的研究報(bào)道［7-9］。微生物發(fā)酵法作為一種新的制備抗氧化肽的方法，有其良好的優(yōu)越性［10-12］:微生物蛋白酶來(lái)源廣、酶產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低。目前，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)酵法的方法制備抗氧化肽不多，僅有少數(shù)幾篇［13-16］。由此可見(jiàn)，研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣有著重要的作用和意義，以發(fā)酵產(chǎn)物的還原力為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的不斷優(yōu)化，以期為微生物發(fā)酵法在制備大米抗氧化肽工藝中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料和培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:蛋白胨3 g，NaCl 0.5 g，牛肉膏0.5 g，葡萄糖0.1 g，水100 mL，pH 7.2。121℃下滅菌20 min，冷卻待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基:米渣，NaCl 0.5 g，葡萄糖0.1 g，水100 mL。121℃下滅菌20 min，冷卻待用。

1.2主要儀器與設(shè)備

立式滅菌鍋:LMQ.CJ山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；紫外分光光度計(jì):UV-18000 Spectrophotometer上海美譜達(dá)儀器有限公司:電子天平:BS224S北京賽多利斯儀器有限公司。水浴恒溫振蕩器:SHZ-82上海浦東物理光學(xué)儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱: 101A-3ET上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋:上海浦東物理光學(xué)儀器廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱:上海新苗醫(yī)療器械有限公司；高速多功能粉碎機(jī):上海冰都電器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1制備米渣抗氧化肽的工藝流程 米渣→粉碎→過(guò)篩→接種→發(fā)酵→離心分離→冷凍干燥并保存樣品→抗氧化活性測(cè)定

1.3.2枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的制備 將保藏完好的枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌種活化；將活化好的枯草芽孢桿菌斜面菌種單菌落接入滅菌后的種子液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，采用比濁法測(cè)定，用枯草芽孢桿菌菌種未接種的種子液體培養(yǎng)基作空白，在波長(zhǎng)600 nm條件下，分別測(cè)定在6、12、18、24、30、36、42、48 h時(shí)的吸光度；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線圖。

(2)學(xué)生活動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)不等于學(xué)生的參與度高，關(guān)鍵要看學(xué)生活動(dòng)中動(dòng)腦和動(dòng)手是不是相輔相成，是不是統(tǒng)一的整體．在思路5中，得到α2-α1=90° 后，教師提示“既然求角的正切值行不通，那么求余弦值會(huì)怎樣？大家試一試．”和教師提示“既然求角的正切值行不通，大家看看有沒(méi)有其他辦法？”兩種提示下，學(xué)生都要?jiǎng)邮謬L試，但前者只是被動(dòng)的活動(dòng)，學(xué)生思維并沒(méi)有真正參與，“為什么求余弦”這個(gè)重要的“思維起點(diǎn)”被忽視了；后者則是腦與手聯(lián)動(dòng)，如果學(xué)生自己意識(shí)到求余弦時(shí)，動(dòng)手的活動(dòng)就具有思維的含量了，如果多數(shù)學(xué)生意識(shí)不到，那么教學(xué)重心應(yīng)放在引導(dǎo)學(xué)生發(fā)現(xiàn)“求余弦”上．總之，不要讓學(xué)生成為驗(yàn)證教師想法的工具．

1.3.3米渣抗氧化肽的制備方法 將保藏完好的枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌種活化；將活化好的枯草芽孢桿菌斜面菌種單菌落接入滅菌后的種子培養(yǎng)基中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，種子發(fā)酵液的含菌量為107-108 cfu/mL；將得到的種子液培養(yǎng)基以4%-8%的接種量接入裝有300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶，發(fā)酵溫度28-36℃，培養(yǎng)12-60 h；菌株發(fā)酵液在100℃下滅酶10 min，待發(fā)酵液冷卻至室溫以4 000 r/min離心10 min去除菌體和未發(fā)酵的米渣殘?jiān)?，得到發(fā)酵上清液。取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，并把濾過(guò)液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，凍干至粉末狀，即得產(chǎn)品為米渣蛋白抗氧化肽。

1.3.4米渣抗氧化肽抗氧化活性的測(cè)定 抗氧化劑是通過(guò)自身的還原給出電子而清除自由基的，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，因此可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的強(qiáng)弱［13］。還原性測(cè)定［14］方法如下:用蒸餾水將各粉末狀米渣抗氧化肽配制成1 mg/mL的抗氧化肽溶液。取抗氧化肽水溶液2 mL，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH=6.6）5 mL和1%鐵氰化鉀5 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入10%的三氯乙酸10 mL，經(jīng)充分混合后以3 000 r/min離心10 min。吸取上清液5 mL，加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，在700 nm處測(cè)定吸光值，吸光值增加表明還原力增強(qiáng)。

1.3.5單因素試驗(yàn) 在固定條件:料液比1∶3（g/ mL）、接種量5%、發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間48 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽，將發(fā)酵粗提物濃縮冷凍干燥成粉末狀米渣抗氧化肽并配制成1 mg/mL的抗氧化肽溶液，取抗氧化肽水溶液2 mL進(jìn)行還原力測(cè)定。分別考察料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7；接種量為3%、4%、5%、6%、7%；發(fā)酵時(shí)間為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h；發(fā)酵溫度為30℃、32℃、34℃、36℃、38℃條件下對(duì)制備的米渣抗氧化肽還原力的影響。

1.3.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素研究基礎(chǔ)上，采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣，以發(fā)酵產(chǎn)物的還原力為指標(biāo)，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最佳的料液比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間。如表1所示。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Tab.1　Fermentation test factors and levels

2　結(jié)果與分析

2.1枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

通過(guò)采用比濁法測(cè)定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)中不同時(shí)段的吸光度，可以得到枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，枯草芽抱桿菌接種后30 h達(dá)最大吸光度，在這之前生長(zhǎng)速度提高較快，36 h以后隨著液體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。所以枯草芽孢桿菌種子液以培養(yǎng)24 h接種比較合適。

圖1　枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curve of Bacillus subtilis

2.2單因素試驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.2.1料液比對(duì)發(fā)酵制備的米渣抗氧化肽還原力的影響 由圖2可知，料液比對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備的抗氧化肽還原力有顯著的影響。隨著料液比不斷的增大，發(fā)酵液的吸光度值不斷減小，表明米渣抗氧化肽的還原能力呈下降趨勢(shì)，料液比為1∶3時(shí)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備的抗氧化肽的還原能力最強(qiáng)，吸光度為1.621。但是并不是料液比越小越好，若料液比繼續(xù)減小，米渣發(fā)酵不充分，造成米渣資源浪費(fèi)。故選擇料液比1∶4左右為宜。

圖2　料液比對(duì)發(fā)酵制備米渣抗氧化肽還原力的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the reducing power of rice residue antioxidant peptides

2.2.2接種量對(duì)發(fā)酵制備的米渣抗氧化肽還原力的影響 由圖3可知，接種量5%時(shí)，米渣抗氧化肽的還原能力最強(qiáng)，吸光度值為1.724。接種量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致米渣抗氧化肽還原力的降低。當(dāng)接種量過(guò)高，但是發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，不能滿足枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的需要，從而導(dǎo)致米渣抗氧化肽的還原能力下降。當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，米渣不能被充分分解，不僅還原力下降，還導(dǎo)致資源浪費(fèi)。故接種量5%左右最合適。

圖3　接種量對(duì)發(fā)酵米渣制備抗氧化肽還原力的影響Fig.3　Effect of inoculation quantity on the reducing power of rice residue antioxidant peptides

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)制備的米渣抗氧化肽還原力的影響 由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵產(chǎn)物米渣抗氧化肽的還原能力呈逐漸上升趨勢(shì)，發(fā)酵48 h后米渣抗氧化肽的還原能力下降。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，米渣抗氧化肽的還原能力最強(qiáng)，吸光度值為1.647。這說(shuō)明適宜的發(fā)酵時(shí)間有利于產(chǎn)生較強(qiáng)還原能力的米渣抗氧化肽。有可能原因是在適宜的發(fā)酵時(shí)間下，蛋白質(zhì)的分解會(huì)產(chǎn)生大量的短肽產(chǎn)物，但隨著發(fā)酵時(shí)間增加，具有還原能力的短肽會(huì)被進(jìn)一步水解，使其還原能力降低或者完全喪失；也有可能發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使蛋白酶解程度的加劇，會(huì)有一些沒(méi)有明顯還原能力的肽段從蛋白中釋放出來(lái)，導(dǎo)致具有還原能力的肽段在發(fā)酵產(chǎn)物中的比例下降［11］。因此，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，而發(fā)酵產(chǎn)物的還原能力卻呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。故選擇發(fā)酵時(shí)間48 h左右為宜。

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵米渣制備抗氧化肽還原力的影響Fig.4　Effect of fermentation time on the reducing power of rice residue antioxidant peptides

2.2.4發(fā)酵溫度對(duì)制備的米渣抗氧化肽還原力的影響 由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，米渣抗氧化肽的還原力隨之提高，但是溫度超過(guò)32℃，米渣抗氧化肽的還原力有下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度較低時(shí)，枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶緩慢導(dǎo)致米渣抗氧化肽的抗氧化活性程度弱；但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，影響枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，米渣抗氧化肽的抗氧化活性最強(qiáng)，吸光度值為1.775。故選擇枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度為32℃左右為宜。

3　正交試驗(yàn)

3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果與分析

根據(jù)表2中直觀分析極差R值大小可以看出4因素影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽的還原力主次關(guān)系依次為（R）C＞A＞D＞B，說(shuō)明料液比對(duì)制備的米渣抗氧化肽的還原力影響最大，其次依次為發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間。從表2中也可以看出枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽各因素的最佳組合為A1B2C2D2，即發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、料液比1∶4、接種量5%。

圖5　發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵米渣制備抗氧化肽還原力的影響Fig.5　Effect of fermentation temperature on the reducing power of rice residue antioxidant peptides

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2　The results of orthogonal test

3.2驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，吸光度分別為1.899、1.912、1.910，平均吸光度為1.907。彭地緯等人［5］運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解米渣制備抗氧化肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化，最大還原力達(dá)0.688。與之對(duì)比，在此優(yōu)化工藝條件下，枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽的還原能力強(qiáng)，驗(yàn)證了所選工藝的合理性和科學(xué)性。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備抗氧化肽，選取料液比、接種量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度四個(gè)最佳因素進(jìn)行研究?jī)?yōu)化，以枯草芽孢桿菌發(fā)酵米渣制備的米渣抗氧化肽還原力為考核指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明:在料液比為1∶4（g∶v）、接種量為5%、時(shí)間為48 h、溫度為30℃的條件下，制備的米渣抗氧化肽的還原力達(dá)1.907，表現(xiàn)出強(qiáng)的抗氧化活性。

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Optimized Fermentation Conditions for Research on Antioxidant Peptides Prepared from Fermented Rice Residue by Using Bacillus subtilis

LIAO Luyan1，2，ZHANG Yu2*
（Hunan Agricultural University a.College of Orient Science and Technology；b.College of Food Science and Technology，Changsha 410128，Hunan，China）

The rice residue was fermented with Bacillus subtilis to prepare rice residue antioxidant peptides.The effects of fermentation time，fermentation temperature，inoculation quantity and solid-liquid ratio on the reducing power of rice residue antioxidant peptides were investigated.The results showed that the optimal condition was:fermentation time 48 h，fermentation temperature 30℃，inoculation quantity 5%and solid-liquid ratio 1∶4.Under the condition，the reducing power of rice residue antioxidant peptides was 1.907，which shows strong anti oxidation.

Bacillus subtilis；fermentation；reducing power；rice residue；antioxidant peptides

TS210.9

A

1007-7146（2015）04-0368-05

2014-12-16；

2015-01-31

湖南省教育廳一般項(xiàng)目（14C0566）

廖盧艷（1982-），女，湖南岳陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，在讀博士，研究方向?yàn)榧Z食深加工及開(kāi)發(fā)利用。（電子郵箱）120425073@qq.com

張喻（1972-），女，湖南益陽(yáng)人，教授，博士，主要研究方向?yàn)榧Z食深加工及開(kāi)發(fā)利用。（電子郵箱）skxzhangyu@163.com