鐘會(huì)清，楊　輝，周　艷，郭周義*，黃漢傳，葉丙剛，倪藝榕，熊紅蓮，金 梅，吳秀麗，蘇成康，龍 佳，林 錦

（1.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥與光子技術(shù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631；2.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州510623）

微激光照射肥大細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響*

鐘會(huì)清1，楊輝2，周艷2，郭周義1*，黃漢傳1，葉丙剛1，倪藝榕1，熊紅蓮1，金 梅1，吳秀麗1，蘇成康1，龍 佳2，林 錦2

（1.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥與光子技術(shù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631；2.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州510623）

目的：研究850 nm波長(zhǎng)微激光對(duì)肥大細(xì)胞照射后胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。方法：實(shí)驗(yàn)前12 h，將肥大細(xì)胞接種于激光共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，然后用D-Hank's液洗滌3次，加入2 mL D-Hank's液，按照照射時(shí)間不同共分六組（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min），其中，空白對(duì)照組不進(jìn)行激光照射處理；激光照射后，棄去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培養(yǎng)箱中孵育30 min后，用D-Hank's液洗滌3次去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果：空白對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)熒光，說(shuō)明此時(shí)胞內(nèi)無(wú)鈣離子，但從1 min開(kāi)始在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)熒光，而且發(fā)現(xiàn)隨著照射時(shí)間的加長(zhǎng)，其熒光強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)，這可能與微激光照射時(shí)間越長(zhǎng)從而刺激胞內(nèi)出現(xiàn)更多的鈣離子有關(guān)。從上面的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明850 nm微激光能作為仿灸儀器的光源。

生物光學(xué)；細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；微激光；肥大細(xì)胞；激光掃描共聚焦顯微鏡

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.004

0　引言

激光針灸是一種新的針灸療法，它通過(guò)采用激光照射人體穴位替代傳統(tǒng)毫針刺激穴位實(shí)現(xiàn)針灸治療的目的［1-3］。和傳統(tǒng)的毫針針灸相比，激光針灸具有非侵入性的特點(diǎn)，能降低因重復(fù)使用針具而發(fā)生交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。而且，激光針灸能緩解部分暈針患者（特別是兒童患者）對(duì)針具的恐懼心理。有研究表明激光針灸鎮(zhèn)痛具有良好的療效。Sven Gottschling等人采用830 nm激光器治療患有頭痛的兒童患者，激光輻照的穴位點(diǎn)選擇“合谷”、“足三里”、“三陰交”等。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示激光針灸組的治療相對(duì)于對(duì)照組具有顯著效果［4］。但是由于激光器的成本過(guò)高及操作復(fù)雜阻礙了它的應(yīng)用進(jìn)一步推廣［5］。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，新型的LED將以其在光強(qiáng)、波長(zhǎng)、價(jià)格、壽命、外型尺寸等方面的優(yōu)勢(shì)和與激光光源治療具有相似的療效成為醫(yī)療的新能源。例如前期王波等人已研究采用635 nm LED穴位照射對(duì)腎陽(yáng)虛模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)635 nm LED照射與艾灸療法對(duì)腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物的治療具有相似的療效，說(shuō)明635 nm LED可做為仿灸儀器［6，7］。

雖然針灸鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其作用機(jī)制已得到廣泛研究并取得了一定的進(jìn)展，但是有關(guān)激光針灸鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究相對(duì)較小，而且人們對(duì)其作用機(jī)制知之甚少。大量中醫(yī)研究表明機(jī)體穴位區(qū)肥大細(xì)胞參與鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而肥大細(xì)胞的脫顆粒線顯示產(chǎn)生此效應(yīng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)的目的主要研究850 nm微激光對(duì)肥大細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。

1　材料與方法

1.1激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscopy，LSCM）是采用激光作為激發(fā)光源，激光束經(jīng)顯微鏡光學(xué)部件后照射熒光標(biāo)記的樣本上，激發(fā)出的熒光信號(hào)被光檢測(cè)器接收。該技術(shù)是在熒光顯微分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，利用熒光顯微鏡可以對(duì)生物樣品發(fā)出的熒光進(jìn)行觀察和分析。采用通過(guò)針孔，擋住非焦平面的散射光，以減少焦平面上非測(cè)量點(diǎn)光信號(hào)干擾，通過(guò)掃描技術(shù)，可以獲取細(xì)胞內(nèi)某個(gè)薄層面上的熒光信息，成像清晰程度得到大大提高。同時(shí)，通過(guò)顯微鏡自帶的部件和軟件，可以實(shí)現(xiàn)樣品的Z軸掃描和三維重構(gòu)。當(dāng)物鏡折射率一致時(shí)，采用激光掃描共聚焦顯微鏡可以使分辨率提高1.4倍，能夠在亞細(xì)胞水平上觀察諸如鈣離子、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。激光掃描共聚焦顯微鏡廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究中，其中最常見(jiàn)的應(yīng)用是熒光定性和定量檢測(cè)［8，9］。例如，李瑞午等提出利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究針灸經(jīng)絡(luò)的思想，并觀察電針血清與正常血清對(duì)體外培養(yǎng)的大腦皮層細(xì)胞鈣離子的影響［10，11］。

1.2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子

鈣信號(hào)在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和執(zhí)行功能等各個(gè)方面都發(fā)揮著重要的作用，影響著從卵子受精到細(xì)胞調(diào)亡的整個(gè)生命過(guò)程。Ca2+既能充當(dāng)?shù)谝恍攀箚?dòng)信號(hào)傳遞過(guò)程，也能充當(dāng)?shù)诙攀?，同時(shí)還調(diào)控細(xì)胞的生命過(guò)程，如遞質(zhì)釋放、腺體分泌，肌肉收縮到細(xì)胞受精、發(fā)育、分化、凋亡等，都和鈣離子有關(guān)。靜息情況下，細(xì)胞外Ca2+濃度在mmol/L量級(jí)，而胞內(nèi)Ca2+濃度（［Ca2+］）則為μmol/L水平，兩者相差1 000i～10 000倍［12，13］。

1.3胞內(nèi)鈣離子的熒光測(cè)定法

Fluo-3是一種長(zhǎng)波鈣熒光探針。因?yàn)榧す鈷呙韫簿劢癸@微鏡具有氬激光器，所以Fluo-3被廣泛使用于這種顯微鏡上。這種熒光信號(hào)發(fā)出來(lái)的長(zhǎng)波也有利于減小對(duì)樣品細(xì)胞的光損傷。Fluo-3/AM是Fluo-3的一種乙酰甲酯（Acetoxymethyl ester，AM）衍生物，脂溶性，很容易透過(guò)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，但不和鈣離子結(jié)合，沒(méi)有熒光，該探針是應(yīng)用最廣泛的幾種檢測(cè)鈣離子濃度的探針之一。當(dāng)FLuo-3/AM被細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化失去AM后，產(chǎn)生的Fluo-3變成水溶性而不能透過(guò)胞膜流出細(xì)胞外。Fluo-3若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與鈣離子結(jié)合后熒光會(huì)增加60～80倍。

1.4主要試劑與儀器參數(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、共聚焦培養(yǎng)皿（Cornning公司）。Fluo-3/AM（鈣離子熒光探針，Biotium）；DHank's液:自行配置；胎牛血清（FBS，Gibco公司）。

激光掃描共聚焦顯微鏡LSM710（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，如圖1）:德國(guó)ZEISS公司，參數(shù)設(shè)置如下:60倍油鏡，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，探測(cè)器波長(zhǎng)范圍為490 nm～600 nm。

1.5微激光處理

采用中心波長(zhǎng)在850 nm的近紅外LED（FWHM =30 nm）（圖2），24個(gè)LED燈珠以6×4排列方式組合成一個(gè)LED陣列，其大小主要根據(jù)96孔板的大小來(lái)定。

圖1　激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM710）Fig.1　Laser scanning confocalmicroscopy（LSM710）

圖2　850 nm LED的光譜Fig.2　The spectrum of LED with a central wavelength of 850 nm

1.6實(shí)驗(yàn)方法

選用RBL-2H3細(xì)胞為細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)前12 h，將RBL-2H3細(xì)胞接種于激光共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中；開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，配置好10 μmol/L的Fluo-3/AM溶液（50 μg溶于22 μL DMSO，再用D-Hank's液稀釋到4.4 mL），然后放入在37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min備用；將已接種于激光共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用D-Hank's液洗滌3次，加入2 mL D-Hank's液，分六組，每組按照表1的處理方法進(jìn)行照射，其中，空白對(duì)照組不進(jìn)行微激光照射處理；微激光照射后，棄去D-Hank's液，加入含有Fluo-3/AM的D-Hank's液1 mL，放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵育30 min后，棄去含F(xiàn)luo-3/AM的D-Hank's液，用D-Hank's液洗滌3次以去除胞外多余的Fluo-3/AM，再加入含有10%FBS的D-Hank's液2 mL，置激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

2　結(jié)果和分析討論

表1　850 nm的微激光照射肥大細(xì)胞時(shí)所對(duì)應(yīng)的功率密度和能量密度Tab.1　The power density and energy density of 850 nm micro-laser irradiated mast cells

圖3　肥大細(xì)胞經(jīng)中心波長(zhǎng)為850 nm微激光分別照射0 min和1 min后鈣離子顯微成像（左邊圖為白光圖，中間圖為純熒光圖，右邊圖為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.3　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 0 min and 1 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖4　肥大細(xì)胞經(jīng)中心波長(zhǎng)為850 nm微激光分別照射2 min和2.5 min后鈣離子顯微成像（左邊為白光圖，中間為純熒光圖，右邊為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.4　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 2 min and 2.5 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖5 肥大細(xì)胞經(jīng)中心波長(zhǎng)為850 nm微激光分別照射3 min和4 min后鈣離子顯微成像（左邊為白光圖，中間為純熒光圖，右邊為白光圖和熒光圖合并圖）Fig.5　The confocal microscope images of［Ca2+］i in mast cells by 850 nm micro-laser irradiated 3 min and 4 min（white light image（left），fluorescence image（middle），white light and fluorescence（right））

圖3為肥大細(xì)胞經(jīng)中心波長(zhǎng)850 nm微激光照射0 min和1 min后的熒光圖，從圖上發(fā)現(xiàn)在微激光照射0 min（空白對(duì)照組，即微激光光源處于關(guān)閉狀態(tài)）未見(jiàn)熒光，但是相同參數(shù)下測(cè)得經(jīng)850 nm微激光的光照射肥大細(xì)胞1 min熒光圖片上可見(jiàn)微弱的熒光，說(shuō)明肥大細(xì)胞經(jīng)中心波長(zhǎng)850 nm微激光刺激1 min能使其鈣離子濃度升高。

圖4和圖5分別是在相同激光掃描共聚焦顯微成像的參數(shù)下測(cè)得經(jīng)850 nm微激光的光照射肥大細(xì)胞2 min、2.5 min、3 min、4 min。從圖上可見(jiàn)隨著照射時(shí)間的加長(zhǎng)，胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度也隨著增加，這可能是因?yàn)楣饩男?yīng)作用分子能夠引起活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子增加。前期黃義梅等人研究得出光灸效應(yīng)作用分子引起鈣離子濃度升高的途徑可能為兩種:第一種是細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，另一種是細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子可能是光灸效應(yīng)作用分子引起細(xì)胞質(zhì)中鈣離子升高的主要原因［14，15］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與黃義梅研究結(jié)果一致。另外還發(fā)現(xiàn)在照射后2 min、2.5 min和3 min細(xì)胞形態(tài)較完整。但是經(jīng)850 nm微激光照射肥大細(xì)胞4 min后，有小部分肥大細(xì)胞破碎喪失細(xì)胞完整性，說(shuō)明該劑量的微激光輻射對(duì)細(xì)胞會(huì)造成損傷。

本實(shí)驗(yàn)中，使用微激光850 nm波長(zhǎng)的光照射肥大細(xì)胞的結(jié)果表明，850 nm的光能夠有效刺激肥大細(xì)胞胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子至細(xì)胞質(zhì)中以引發(fā)進(jìn)一步細(xì)胞反應(yīng)，例如肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺。同時(shí)因?yàn)榇罅恐嗅t(yī)研究表明機(jī)體穴位區(qū)肥大細(xì)胞參與鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而肥大細(xì)胞的脫顆粒線顯示產(chǎn)生此效應(yīng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生組胺、P物質(zhì)可通過(guò)以下兩種方式共同作用到靶器官:①通過(guò)組織液定向流動(dòng)傳遞到沿經(jīng)脈線上的其他肥大細(xì)胞處誘使其進(jìn)一步脫顆粒；②活性物質(zhì)刺激神經(jīng)末梢引起軸索反射，再次釋放P物質(zhì)，誘發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒，顆粒物質(zhì)進(jìn)一步刺激相鄰神經(jīng)末梢，如此往復(fù)，光灸神經(jīng)興奮信號(hào)在不同階段被整合和修飾后產(chǎn)生鎮(zhèn)痛和其他靶器官調(diào)整效應(yīng)。

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The Effect of Micro-laser on Intracellular Free Calcium Concentration of Mast Cell

ZHONG Huiqing1，YANG Hui2，ZHOU Yan2，GUO Zhouyi1*，HUANG hanchuan1，YE Bingang1，NI Yirong1，XIONG Honglian1，JIN Mei1，WU Xiuli1，SU Chengkang1，LONG Jia2，LIN Jin2
（1.SATCM Third Grade Laboratory of Chinese Medicine and Photonics Technology，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China；2.Infinitus（China）Company Ltd，Guangzhou 510623，Guangdong，China）

Objective:To investigate the effects of micro-laser irradiation on intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）of mast cell.Methods:12 hours before the experiment，The mast cells were seeded into paltes，which wereused on the laser scanning confocal microscopy（LSCM）.Then the cells were washed three times with D-hank's solution，and added 2 mL D-hank's solution to each group.There were six groups，which were irradiated at different times（Control，1 min，2 min，2.5 min，3 min，4 min）by micro-laser 850 nm.The control group was irradiated 0 min.After micro-laser irradiation，the cells were removed the D-hank's solution，and loaded with 1 mL Fluo-3/AM at 37°C for 30 min.The cells were washed again for another three times with D-hank's solution to remove the unloaded Fluo-3/AM in the medium，and then added 2 mL D-hank's solution with 10%FBS.The images of Ca2+concentration in each group cells were monitored by LCSM.Result:The results have shown that there were no fluorescence in the control group.It clearly indicated that there were no Ca2+in the control group cells.But in the irradiated 1 min group，there was significant fluorescence.Following the time of irradiation increasing，the fluorescence intensity were enhanced.The intracellular calcium concentration become higher，which may be related to the micro-laser irradiation time increase.It has shown that the 850 nm micro-laser could be the optical source of moxibustion instrument.

biological optics；intracellular calcium concentration（［Ca2+］i）；micro-laser；mast cell；laser scanning confocal microscopy（LSCM）

Q682

A

1007-7146（2015）04-0326-05

2015-05-24；

2015-06-02

無(wú)限極（中國(guó)）有限公司委托重大技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（HPG/2013/11/1598）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 61335011，No61275187；No.31300691&No.11404116）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（No.20114407110001&No.20134407120003）；廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No.2014A030311024）；廣東省重大科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（No.2012A080203008）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.2013KJCX0052）

鐘會(huì)清（1979-），女，湖南衡陽(yáng)，講師。研究方向:生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)、光譜檢測(cè)與成像、光學(xué)診斷。（電子郵箱）zhonghq@scnu.edu.cn

郭周義（1965-），男，浙江諸暨人，教授，博士生導(dǎo)師。（電子郵箱）ann@scnu.edu.cn