李藝容，林黎升，劉麗娜，陳德福，，顧 瑛，李步洪*

（1.醫(yī)學(xué)光電信息科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院激光醫(yī)學(xué)科，北京100853）

漫反射光譜測(cè)量皮窗模型中血管的血氧飽和度*

李藝容1，林黎升1，劉麗娜1，陳德福1，2，顧 瑛2，李步洪1*

（1.醫(yī)學(xué)光電信息科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院激光醫(yī)學(xué)科，北京100853）

血管中的血氧飽和度（Oxygen saturation，StO2）作為影響血管靶向光動(dòng)力療法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）療效的關(guān)鍵要素之一，實(shí)驗(yàn)測(cè)量了活體裸鼠背皮窗模型中血管的漫反射光譜（450-800 nm），并通過擬合漫反射光譜數(shù)據(jù)定量獲得了血管中的StO2。同時(shí)，研究了高氧、低氧和常氧等三種不同氧條件下V-PDT中血管的StO2和血管管徑的變化情況。結(jié)果表明，高氧和常氧條件下的平均StO2和血管收縮較為顯著，但低氧組的平均StO2和血管收縮不明顯。在相同氧條件和不同光照功率密度條件下，V-PDT前后靶向血管的平均StO2與血管管徑的變化之間沒有顯著相關(guān)性，但V-PDT前后平均StO2的變化量與光照功率密度之間呈正相關(guān)。

血管靶向光動(dòng)力療法；皮窗模型；漫反射光譜；血氧飽和度；血管收縮率

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.003

血管靶向光動(dòng)力療法（Vascular targeted photodynamic therapy，V-PDT）是一種聯(lián)合利用光、光敏劑和氧分子，通過一系列光物理化學(xué)反應(yīng)消耗氧分子［1］，產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2）等活性氧物質(zhì)并引起血管損傷的靶向療法。V-PDT已廣泛應(yīng)用于選擇性治療血管性疾病，如前列腺腫瘤、鮮紅斑痣和老年性黃斑變性等［2］。在V-PDT過程中，氧的消耗會(huì)造成靶向血管中氧分子的減少，從而可能降低活性氧物質(zhì)的產(chǎn)量，進(jìn)而影響V-PDT的療效［3］。與此同時(shí)，血液中氧含量變化還將改變組織的光學(xué)特性，影響V-PDT的治療深度和治療效果［4］。因此，監(jiān)測(cè)V-PDT中靶向血管內(nèi)的氧含量對(duì)于實(shí)時(shí)優(yōu)化和調(diào)整的治療方案，提高療效具有重要的意義。

研究表明可以采用核磁共振［5］、頻域光子遷移光譜［6］和傅里葉變換光譜成像［7］、光聲顯微成像［8］、多光譜成像［9］以及反射光譜［10］等技術(shù)測(cè)量血液中的氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度并計(jì)算獲得組織中的StO2，從而間接地獲得組織中的氧含量。與其它技術(shù)相比，漫反射光譜技術(shù)通過便攜式光譜儀實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集，測(cè)量裝置相對(duì)簡(jiǎn)單，具有無(wú)損、快速、可重復(fù)和高性價(jià)比等優(yōu)點(diǎn)而在臨床上得到了初步的應(yīng)用。Wang等人利用漫反射光譜研究了PDT前后C3H小鼠中RIF腫瘤的StO2相對(duì)變化量，并發(fā)現(xiàn)StO2相對(duì)變化量與PDT療效之間呈正相關(guān)性［11］。Woodhams等人利用可見光反射光譜實(shí)驗(yàn)研究了組織壞死程度與StO2的關(guān)聯(lián)性，保持相同治療光劑量，當(dāng)激光功率密度較低時(shí)，被測(cè)組織StO2減少緩慢且變化量越小，但組織壞死程度越高［12］。此外，王穎等使用漫反射光譜技術(shù)臨床監(jiān)測(cè)V-PDT治療鮮紅斑痣過程中氧含量的變化，通過觀察漫反射光譜特征變化來(lái)反應(yīng)不同顏色病變組織StO2的變化情況［13］。上述研究表明漫反射光譜技術(shù)可用于組織StO2的檢測(cè)，但尚未見活體鼠背皮窗模型中血管的StO2的漫反射光譜檢測(cè)以及StO2與血管形態(tài)變化關(guān)系的研究報(bào)道。

本文首先驗(yàn)證了漫反射光譜技術(shù)檢測(cè)鼠背皮窗內(nèi)血管StO2的可行性，分別獲得了鼠背皮窗模型中血管在V-PDT前后StO2的變化關(guān)系。其次，研究了不同氧條件對(duì)V-PDT血管管徑變化的影響，并分析在相同治療光劑量條件下，StO2的變化量與激光光照功率密度和血管管徑變化之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1化學(xué)藥物

采用光敏劑玫瑰紅（Rose bengal，RB）（Sigma-Aldrich.，St.Louis，USA）開展V-PDT實(shí)驗(yàn)。將RB溶于生理鹽水制備成濃度為12.5 g/mL的儲(chǔ)存液，放置于4℃避光環(huán)境中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將儲(chǔ)存液稀釋至所需給藥劑量濃度，光敏劑溶液制備在暗室條件下完成。

1.2裸鼠脊背皮窗模型

實(shí)驗(yàn)采用年齡大約10-12周，體重為25-30 g的雄性BALB/c裸鼠（Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.Ltd.，Shanghai，China）建立裸鼠脊背皮窗模型［14］。按每公斤體制80～90 mg/kg的劑量將戊巴比妥鈉溶液（北京化學(xué)試劑公司）經(jīng)腹腔注射使裸鼠處于麻醉的狀態(tài)后，通過手術(shù)在裸鼠背部縫合安裝鈦合金皮窗（SM100，APJ Trading Co.，Ventura，USA），在鼠背皮窗一側(cè)去除一層直徑為10 mm區(qū)域的皮層，之后將圓形玻璃蓋玻片放置于皮層去除區(qū)域，該模型可全視窗直接觀察表皮和皮下血管。

1.3V-PDT實(shí)驗(yàn)

裸鼠經(jīng)戊巴比妥鈉溶液麻醉后，通過尾緣靜脈注射RB溶液（給藥劑量25 mg/kg）后立即進(jìn)行VPDT照光。所用的治療光源為532 nm半導(dǎo)體激光器（Changchun new industries optoelectronics technology Co.，Ltd.，China），經(jīng)光纖（R400-7-UV-VIS，ocean optics Inc.，USA）耦合后均勻地輻射靶向區(qū)域。VPDT過程中將裸鼠放置于加熱墊上以確保其體溫維持正常（33-34℃）［16］。為了消除測(cè)試過程中外界環(huán)境和動(dòng)物的抖動(dòng)帶來(lái)的影響，所有的測(cè)試均在黑暗的環(huán)境中且在固定的操作臺(tái)上進(jìn)行。

18只鼠背皮窗模型隨機(jī)分成三組開展不同氧條件的V-PDT實(shí)驗(yàn)，分為高氧組、低氧組和常氧組（n= 6）。高氧組裸鼠在V-PDT過程中吸入Carbogen氣體（95%O2和5%CO2），低氧組裸鼠吸入氮氧混合氣體（92%N2和8%O2），常氧組則正常呼吸空氣。實(shí)驗(yàn)采用光功率密度100 mW/cm2進(jìn)行照光，照光時(shí)間為300 s，每次V-PDT治療的光劑量均為30 J/cm2。在常氧組中還開展了不同光照功率密度的V-PDT對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在上述100 mW/cm2（n=6）光照實(shí)驗(yàn)組的基礎(chǔ)上，增設(shè)了50 mW/cm2（n=6）和200 mW/cm2（n=7）光照實(shí)驗(yàn)組，對(duì)應(yīng)的照光時(shí)間分別為600和150 s。同時(shí)還增加了1個(gè)無(wú)光敏劑無(wú)光照的空白對(duì)照組（n=2）和3個(gè)無(wú)光敏劑有光照的光照對(duì)照組（50 mW/cm2（n=2），100 mW/cm2（n=2）和200 mW/cm2（n=2））。

1.4白光圖像采集

實(shí)驗(yàn)采用徠卡體式顯微鏡（Leica MZ 16FA，Wetztar，Germany）分別在V-PDT前后對(duì)靶向區(qū)域的血管進(jìn)行8×觀察并采集鼠背皮窗的白光圖像。

1.5漫反射光譜測(cè)量

利用自行研發(fā)漫反射光譜系統(tǒng)在V-PDT治療前后分別對(duì)靶向區(qū)域進(jìn)行漫反射光譜數(shù)據(jù)采集［17］。漫反射光譜系統(tǒng)由鹵素?zé)簦℉L-2000-HP，Ocean Optics Inc.，USA），傳輸和收集光的Y型光纖（200 μm core diameter，NA=0.22，Ocean Optics Inc.）以及微型光纖光譜儀（QE65000，Ocean Optics Inc.，USA）組成。

首先采集暗背景光譜和鹵素?zé)艄庠吹膮⒖脊庾V，參考光譜測(cè)量利用漫反射標(biāo)準(zhǔn)白板（WS-1，Ocean Optics Inc.）反射率＞95%，獲得鹵素?zé)艄庠吹膮⒖脊庾V并存儲(chǔ)。然后將QE65000微型光譜儀測(cè)量模式設(shè)置為漫反射光譜測(cè)量模式。測(cè)量時(shí)在所有的皮窗模型中，V-PDT前后分別選取3個(gè)感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行漫反射光譜數(shù)據(jù)采集（波長(zhǎng)范圍為450-800 nm），對(duì)每一個(gè)采集區(qū)域進(jìn)行三次測(cè)量。測(cè)量過程中光纖探頭與血管保持垂直測(cè)量的角度且緊貼于血管。最后，對(duì)所測(cè)量的漫反射光譜進(jìn)行擬合，獲得靶向區(qū)域血管中的StO2。

1.6血管中的StO2

血管中的StO2取決于血管內(nèi)氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度，其特征值表示為式（1）: CHbO2和CHb分別表示氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度［18］。

對(duì)扣除暗背景和標(biāo)準(zhǔn)白板反射譜后的漫反射光譜根據(jù)式（2）進(jìn)行擬合計(jì)算獲得［19］。

其中C是反射信號(hào)的振幅，ρ是相對(duì)血液體積分?jǐn)?shù)，μαHbO2血液中完全含氧的吸收系數(shù)，μαHb（λ）血液中完全缺氧的吸收系數(shù)。其中平均StO2變化量指的是單個(gè)皮窗模型中各個(gè)采集區(qū)域V-PDT前與V-PDT后StO2的變化量取平均。

此外，利用Leica Qwin軟件（version 3.2.0，Leica，Cambridge，UK）定量分析鼠背皮窗血管白光圖像獲得血管管徑的變化，其中血管收縮率可定義為［20］:

其中，Dbefore和Dafter分別表示V-PDT前后靶向血管的管徑。

2　結(jié)果與討論

2.1白光圖像和漫反射光譜

圖1（a）和（b）分別給出了輻射光功率密度為100 mW/cm2的V-PDT前后鼠背皮窗的白光圖像，其中黑色圓圈ROI-1，ROI-2和ROI-3為StO2的測(cè)量位置。V-PDT后靶向區(qū)域血管出現(xiàn)局部收縮，血管管徑減小。圖1（c）和（d）中三條曲線分別對(duì)應(yīng)的是VPDT前和V-PDT后血管ROI-1，ROI-2和ROI-3的漫反射光譜和擬合曲線，V-PDT前后血管的漫反射光譜形狀發(fā)生了顯著變化，V-PDT前在542和577 nm處存在明顯的吸收峰使得譜線呈現(xiàn)W型，而V-PDT后譜線則變?yōu)閂型，這與王穎等人之前的測(cè)量結(jié)果一致［13］，V-PDT后血管中氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的相對(duì)濃度發(fā)生了變化。對(duì)V-PDT前和V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3漫反射光譜分別進(jìn)行擬合獲得相應(yīng)的StO2。結(jié)果發(fā)現(xiàn):V-PDT前ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分別為84.0%，77.8%和75.6%，測(cè)量結(jié)果與Wang等人利用光聲成像技術(shù)測(cè)量的結(jié)果基本一致［8］，即靜脈StO2為70%～75%，動(dòng)脈StO2為90%以上，動(dòng)靜脈平均StO2為80%～82.5%。實(shí)驗(yàn)表明，利用漫反射光譜技術(shù)測(cè)量鼠背皮窗中的血管漫反射光譜，通過數(shù)學(xué)擬合光譜數(shù)據(jù)間接獲得靶向區(qū)域的StO2方法可行，客觀，準(zhǔn)確，為以鼠背皮窗為模型的相關(guān)血氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。V-PDT后ROI-1，ROI-2和ROI-3的StO2分別為16.4%、11.7%、31.3%，與V-PDT前相比各個(gè)靶向區(qū)域的StO2均有顯著下降，這是由于氧的光化學(xué)消耗以及光動(dòng)力效應(yīng)導(dǎo)致血管的封閉引起的［21］。

2.2血管經(jīng)V-PDT后的平均StO2和血管管徑的變化

圖1　皮窗中血管在V-PDT（a）前和（b）后的白光圖像以及對(duì)應(yīng)ROIs在V-PDT（c）前和（d）后的漫反射光譜Fig.1　Stereomicroscope images of blood vessels in the entire dorsal window chamber（a）before and（b）after V-PDT，and the corresponding diffuse reflection spectra of ROIs（c）before and（d）after V-PDT

表1　不同氧條件下血管經(jīng)V-PDT后的平均StO2和血管管徑變化Tab.1　The average StO2and diameter for the blood vessel before and after V-PDT when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions

從表1可以發(fā)現(xiàn)，V-PDT前高氧組血管的平均StO2顯著高于常氧組（P＜0.001），而低氧組的平均StO2則顯著低于常氧組（P＜0.001）。V-PDT前后相比高氧組和常氧組的平均StO2均有顯著降低（P＜0.001），對(duì)應(yīng)的靶向區(qū)域的平均血管管徑顯著減少（P＜0.001），而與低氧組V-PDT前后相比，平均StO2和平均血管管徑雖有減少，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2給出了低氧，高氧和常氧三種不同氧條件下對(duì)應(yīng)的平均血管收縮率情況。由圖2可知高氧組和常氧組的平均血管收縮率較高，且兩組平均血管收縮率無(wú)顯著差別（P＞0.05），而低氧組的平均血管收縮率較?。≒＜0.001）。我們小組之前的研究表面RB溶液在高氧和常氧組氧條件下1O2的發(fā)光強(qiáng)度之間無(wú)明顯差異，而在低氧條件下，1O2發(fā)光強(qiáng)度較?。?2］，這與我們的平均血管收縮率的變化相一致，表明V-PDT過程中1O2在低氧條件下產(chǎn)量降低，導(dǎo)致血管收縮不明顯。

圖2　不同氧條件下血管經(jīng)V-PDT后的平均血管收縮率Fig.2　Theaverage vasoconstrictionsof blood vessels after V-PDT under hypoxic，normoxic and hyperoxic conditions

分析比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組V-PDT前后血管管徑和StO2變化情況，發(fā)現(xiàn)大部分實(shí)驗(yàn)組ROI出現(xiàn)不同程度的收縮現(xiàn)象，相應(yīng)的血管StO2均出現(xiàn)不同程度的下降。實(shí)驗(yàn)組的19只裸鼠中有13只（50 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組5只，100和200 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組各4只）裸鼠血管出現(xiàn)顯著收縮，其平均血管收縮率為56%± 15%。有5只裸鼠（50 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組1只，100 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組1只以及200 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組3只）V-PDT后血管出現(xiàn)輕微收縮，其平均血管收縮率為2 %±1%。另有100 mW/cm2實(shí)驗(yàn)組1只裸鼠出現(xiàn)血管輕微擴(kuò)張，管徑增大，但其對(duì)應(yīng)的StO2在V-PDT后也有所下降。不同激光功率密度下，平均血管收縮率與平均StO2變化量之間沒有顯著的關(guān)聯(lián)性。此外，空白對(duì)照組和光照對(duì)照組均無(wú)觀察到血管收縮或者擴(kuò)張現(xiàn)象，且StO2也未改變。這說(shuō)明僅有光熱效應(yīng)不會(huì)對(duì)血管造成實(shí)質(zhì)性的損傷，對(duì)氧含量的變化亦不會(huì)產(chǎn)生影響，表明V-PDT在一定劑量的光、光敏劑和氧分子共同作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和血小板黏附可引起血管局部收縮［23］。

圖3對(duì)實(shí)驗(yàn)組鼠背皮窗靶向區(qū)域血管的StO2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從圖3我們可以清楚地看到平均StO2變化量與激光功率密度在標(biāo)準(zhǔn)的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系（R2=0.9297）。圖中的誤差是由于裸鼠個(gè)體間差異性導(dǎo)致。隨著輻射光功率密度的增加結(jié)果StO2變化越大，兩者是成正相關(guān)的關(guān)系。在較高功率密度下StO2減少速度快且減少量大。相反，在低光功率密度時(shí)，StO2減少緩慢且變化量小。V-PDT對(duì)照組的StO2前后沒有顯著變化。由于三個(gè)功率密度的照光時(shí)間分別為600 s，300 s和150 s，所以較高功率密度下StO2消耗速度快，這與通過吸收光譜技術(shù)測(cè)量溶液［24］或者腫瘤［18］模型下的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，隨著激光功率密度增大，PDT過程StO2變化得越大且消耗得越快。

圖3　平均StO2相對(duì)變化量與光照功率密度之間的關(guān)系Fig.3　The V-PDT induced change in StO2was positively correlated with various irradiances

3　結(jié)論

光動(dòng)力反應(yīng)導(dǎo)致氧含量的消耗是影響V-PDT療效的一個(gè)關(guān)鍵因素，因此監(jiān)測(cè)StO2的變化以實(shí)時(shí)調(diào)整V-PDT治療方案有助于提高V-PDT的療效。我們驗(yàn)證了利用漫反射光譜技術(shù)檢測(cè)皮窗模型中血管StO2具有可行性。在不同氧條件V-PDT下裸鼠皮窗模型中靶向血管的StO2和血管管徑變化情況不同。高氧組和常氧組的平均StO2減少和平均血管收縮均較為顯著，而低氧組的平均StO2減少和平均血管收縮不明顯。此外，在相同氧條件不同功率密度V-PDT下，靶向血管的平均StO2均有顯著減小，但其變化量與平均血管收縮率之間無(wú)顯著的關(guān)聯(lián)性。同時(shí)，光功率密度越大，靶向血管的StO2減少得越快且越多，平均StO2減少量與激光功率密度之間呈正相關(guān)。

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Measurement of Oxygen Saturation for Blood Vessels in Dorsal Window Chamber Using Diffuse Reflection Spectroscopy

LI Yirong1，LIN Lisheng1，LIU Lina1，CHEN Defu1，2，GU Ying2，LI Buhong1*
（1.Key Laboratory of OptoElectronic Science and Technology for Medicine of Ministry of Education，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350007，F(xiàn)ujian，China；2.Department of Laser Medicine，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Monitoring oxygen saturation changes during vasculartargeted photodynamic therapy（V-PDT）is crucial for achieving an optimal therapeutic outcome.In this study，the diffuse reflection spectra in the range from 450 to 800 nm were measured to quantitatively determine oxygen saturation（StO2）of blood vessels in dorsal skinfold window chamber. Furthermore，the changes of the average StO2and vasoconstriction of blood vessels in the region of interest（ROI）after V-PDT was evaluated when the nude mice breathing either hypoxic，normoxic，or hyperoxic air under normobaric conditions，respectively.The average StO2and vasoconstriction of blood vessels for normoxic and hyperoxic groups after VPDT was dramatically changed while no significant change was found for those of blood vessels in hypoxic group.No consistent pattern for the changes of StO2and vasoconstriction during V-PDT treatment can be observed.However，the V-PDT-induced change in StO2was positively correlated with various irradiances.

vascular targeted photodynamic therapy；dorsal window chamber；diffuse reflection spectroscopy；blood oxygenation saturation；vasoconstriction

Q631

A

1007-7146（2015）04-0320-06

2015-06-18；

2015-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（61275216）；國(guó)家衛(wèi)計(jì)委科學(xué)研究基金（WKJ-FJ-30）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J07008，2014J01225）

李藝容（1989-），男，碩士研究生，主要從事光動(dòng)力療法劑量學(xué)方面研究

李步洪（1973-），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究。（電話）0591-83465373；（電子郵箱）bhli@fjnu.edu.cn