姚翠萍，王萌萌，王　晶，張鎮(zhèn)西

（西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室，陜西西安710049）

基于納米金光學(xué)性質(zhì)的分子檢測與應(yīng)用*

姚翠萍，王萌萌，王晶，張鎮(zhèn)西*

（西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室，陜西西安710049）

納米金顆粒是近年研究最為廣泛的納米材料之一，它具有良好的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性以及獨特的光學(xué)性質(zhì)，在生物分子檢測、診斷和治療方面具有很大的發(fā)展?jié)摿?。尤其是納米金顯示出特殊的表面等離子體共振現(xiàn)象，導(dǎo)致了粒子表面產(chǎn)生強(qiáng)電磁場，并最終增強(qiáng)了諸如吸收和散射的輻射特性，其散射光強(qiáng)與粒子的尺寸和團(tuán)聚狀態(tài)有密切關(guān)系。而由于共振現(xiàn)象而產(chǎn)生的納米金對光的強(qiáng)烈吸收并高效轉(zhuǎn)換為熱效應(yīng)也被用于檢測和治療。此外，與納米金尺寸相關(guān)的局域表面等離子體共振光學(xué)特性，能夠在粒子附近產(chǎn)生很強(qiáng)的電磁場增強(qiáng)，從而構(gòu)成表面增強(qiáng)拉曼散射的基礎(chǔ)。納米金在強(qiáng)光照射下也表現(xiàn)出良好的抗光漂白的熒光現(xiàn)象，其特有的熒光壽命也成為檢測的一種有效手段。與其他熒光物質(zhì)作用時，又表現(xiàn)出表面增強(qiáng)熒光特性以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移。綜述中，在介紹納米金這些特殊光學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，回顧了其在生物分子檢測方面的應(yīng)用進(jìn)展。

納米金；光學(xué)性質(zhì)；生物分子檢測

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.001

0　引言

近幾十年來，研究者們對于納米材料不同于宏觀物質(zhì)的一些特性，例如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)，進(jìn)行了大量的研究。這四種效應(yīng)所引起的納米材料在力學(xué)、磁學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)及光學(xué)等方面的獨特性能，已成為各個領(lǐng)域的研究熱點。納米金顆粒是近些年研究最為廣泛的納米材料之一，表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）是納米金顆粒的一個重要性質(zhì)。在SPR波長處激發(fā)納米金顆粒，能夠產(chǎn)生比在其他波長更強(qiáng)的吸收和散射［1］。納米金顆粒的光學(xué)性質(zhì)易受自身形狀、大小、組成及顆粒間相互作用的影響，如納米金團(tuán)聚或分散時產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化［2，3］。利用這些性質(zhì)將納米金顆粒制成生物探針，通過光譜技術(shù)測定光譜的變化來檢測某種物質(zhì)，已經(jīng)成為一種生物檢測的趨勢。納米金顆粒由于良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性、靈活的合成方法以及易于和抗體等生物分子結(jié)合的優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)檢測、診斷和治療方面有較好的發(fā)展?jié)摿Γ?］。

1　光學(xué)性質(zhì)

當(dāng)激光照射納米金顆粒時，電磁場引發(fā)納米金表面的導(dǎo)帶自由電子振動，這個包圍著粒子表面的電子震蕩就會導(dǎo)致離子晶格中的電荷分離，形成沿著光電場方向的偶極子震蕩。在一個特殊的頻率上振幅達(dá)到最大，被稱為表面等離子體共振。圖1簡單描述了球狀納米金顆粒表面等離子體振蕩的產(chǎn)生過程。入射波電場引起納米金顆粒自由傳導(dǎo)電子的極化，凈電荷差發(fā)生在顆粒表面，過剩的正電荷對鄰近的負(fù)電荷產(chǎn)生庫倫力作用，使鄰近的負(fù)電荷向這個區(qū)域運動；然后該區(qū)域又出現(xiàn)過多的負(fù)電荷，由于電子間的相互排斥作用，電子又遠(yuǎn)離該區(qū)域運動，電子的起伏振蕩發(fā)生在一個周期T內(nèi)。

早在1908年，Mie等人通過求解光與球狀顆粒相互作用的麥克斯韋方程，解釋了單一孤立球狀金屬顆粒的表面等離子體共振性質(zhì)［6］。通過Mie理論計算出的消光截面可由下式表示［7］:

圖1　球狀納米金顆粒表面等離子共振激發(fā)示意圖［5］Fig.1　Schematic diagram of surface plasmon resonance oscillation for a sphere

其中V為納米顆粒體積，ω為激發(fā)光角頻率，c為光速，εm和ε（ω）=ε1（ω）+Iε2（ω）為周圍介質(zhì)和顆粒介質(zhì)的介電函數(shù)。當(dāng)ε1（ω）=-2εm，ε2與εm無關(guān)時，滿足共振條件。

根據(jù)理論分析可知，顆粒的尺寸及形狀改變會引起表面電場密度的改變以及顆粒間的相互作用，導(dǎo)致SPR頻率改變，從而影響顆粒的吸收和散射性質(zhì)。而且，其粒子組成結(jié)構(gòu)及其環(huán)境介質(zhì)的介電常數(shù)也會對其產(chǎn)生影響，Halas等從實驗證明了不同殼核比例的復(fù)合納米顆粒的光學(xué)性質(zhì)也不同［8］。

當(dāng)納米金受到強(qiáng)光照射時，會產(chǎn)生不易漂白的熒光特性［9］。此外，當(dāng)納米金與其他熒光物質(zhì)之間的距離不同時，會出現(xiàn)熒光增強(qiáng)與熒光淬滅兩個效應(yīng)。人們能夠利用這些性質(zhì)，尤其是基于納米金的熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法，對生物分子進(jìn)行檢測。等離子體散射的光頻率與入射光相同，拉曼散射的光頻率則與入射光不同。普通的拉曼散射信號較弱，在實際應(yīng)用中有一定的局限性。通過將金屬納米顆粒作為基底，產(chǎn)生表面增強(qiáng)作用，可以使拉曼散射信號強(qiáng)度大幅提高。

1.1表面等離子體共振吸收

電磁場通過物質(zhì)損失的能量由兩部分組成:吸收和散射。由于非彈性過程，當(dāng)光能被消耗時即為光吸收。在表面等離子體共振發(fā)生時，納米金對光的吸收大幅增強(qiáng)，其程度相對于大多數(shù)有機(jī)染料分子提高5-6個數(shù)量級［4］。對于納米金來說，可見光波長就可以滿足共振條件，因此具有鮮艷的顏色［10］。

不同尺寸、不同形狀的納米金顆粒，顏色也不同。這是由于不同納米金導(dǎo)帶電子的SPR波長不同所致［11］。理論和實驗證明納米顆粒的尺寸和形態(tài)會對SPR吸收峰產(chǎn)生很大的影響。尺寸小于1～2 nm的金屬顆粒，由于它們的能級是離散的，不會發(fā)生SPR現(xiàn)象，而會呈現(xiàn)出與尺寸有關(guān)的熒光性質(zhì)［12］。塊狀材料（Bulk materials）在UV/Vis/IR區(qū)域有連續(xù)的吸收；而在納米尺度內(nèi)的金屬顆粒，SPR波長會落在UV、Vis或IR的某一段區(qū)間，比如金納米球的SPR波長在可見光范圍內(nèi)并且SPR波長隨粒徑變化的程度較??；殼核結(jié)構(gòu)金納米顆粒的SPR波長在近紅外區(qū)域，改變顆粒尺寸或者殼核比例可在較大范圍內(nèi)調(diào)控SPR波長；對于金納米棒，可對其縱橫比進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而大幅度的改變SPR波長［4］。

另外，金納米顆粒之間的相互作用也會對SPR波長造成影響。Sudhanshu等發(fā)現(xiàn)金納米顆粒間距離變化了2.1 nm時，SPR波長移動了84 nm［13］。此時SPR波長發(fā)生改變是由顆粒間的表面等離子體耦合程度變化引起的。納米金顆粒團(tuán)聚時，顏色由紅變紫或藍(lán)，而且SPR帶會變寬；相反，團(tuán)聚的金納米顆粒再次分散則顏色會由紫變紅［14］，分別對應(yīng)于SPR波長紅移和藍(lán)移。這種現(xiàn)象使納米金在比色傳感器方面受到很大的關(guān)注。Shipway等在實驗中發(fā)現(xiàn)，在納米微陣列中，隨著金納米顆粒層的疊加，在520 nm的吸收峰強(qiáng)度增大，且在650 nm處形成一個新的吸收帶［15］。在納米顆粒的組裝或生長過程中，吸收峰強(qiáng)度和波長的增大表明納米結(jié)構(gòu)的尺寸變大。

強(qiáng)表面等離子體吸收性質(zhì)使納米金顆粒具有很好的光熱效應(yīng)。由于電子-聲子和聲子-聲子過程，強(qiáng)吸收光能在皮秒范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為熱。所以，當(dāng)激光照射在表面等離子體吸收帶，納米顆粒吸收光能并迅速轉(zhuǎn)化為熱能。如果納米顆粒和生物分子，細(xì)胞或組織結(jié)合在一起，他們的熱能會引起納米顆粒周圍局部區(qū)域的溫度升高，導(dǎo)致蛋白失活，細(xì)胞膜通透性的改變或細(xì)胞死亡。對于組織，如果加熱（照射）時間特別短，則熱彈性膨脹造成的壓力會導(dǎo)致空化氣泡的產(chǎn)生。當(dāng)一個體積被很快地加熱時，就需要通過熱膨脹產(chǎn)生的壓力波來釋放被加熱的體積，從而產(chǎn)生光聲效應(yīng)。對空話氣泡以及光聲效應(yīng)進(jìn)行檢測，可以測定特定的分子。

1.2散射

當(dāng)光能在發(fā)射光子的物質(zhì)中誘導(dǎo)產(chǎn)生電子振動時，就發(fā)生了光散射，散射光頻率與入射光頻率一致（瑞利散射）或者產(chǎn)生一個頻移（拉曼散射）。頻移對應(yīng)于能量差導(dǎo)致的物質(zhì)內(nèi)部分子運動（分子旋轉(zhuǎn)，拉伸或者振動）。由于SPR震蕩，散射光也被增強(qiáng)，其程度與吸收類似，比大多數(shù)熒光分子的發(fā)射提高5-6個數(shù)量級［4］。

1.2.1等離子體共振散射

金屬納米顆粒在入射光照射下，顆粒表面的等離子體以與入射光相同的頻率共振，并且發(fā)射同頻率的電磁波，即在金屬納米顆粒表面發(fā)生了瑞利散射，也被稱為等離子體散射（Plasmon scatter）［16］。

對于尺寸小于1/20波長的金屬顆粒，可以用瑞利理論來計算散射光強(qiáng)度［17］。在圖2的XYZ坐標(biāo)系中，入射光（單色光）沿Z軸正方向傳播且在Y軸方向振動，散射子位于坐標(biāo)系原點處，r為空間檢測位置與原點的距離，θ和α分別為原點與檢測位置連線和Z軸正半軸、Y軸正半軸的夾角，φ為原點與檢測位置連線在XY平面上的投影與X軸正半軸的夾角。

圖2　計算等離子體散射光強(qiáng)度的照明和檢測系統(tǒng)坐標(biāo)系示意圖［17］Fig.2　Coordinate system for describing the geometrical arrangement of the illuminating and detecting systems

若檢測點在XZ平面上，那么檢測點處的散射光強(qiáng)度IPERP為

式2和式3中，I0為入射光強(qiáng)度，λ0為入射光波長，α為球狀散射子的半徑，r為空間檢測位置與原點的距離，nmed為散射子周圍介質(zhì)的折射率，m為與散射子成份相同的塊狀材料的折射率。由式3可看出，在θ=0°和180°的方向，散射光的強(qiáng)度最大，而在θ=90°和270°時，散射光強(qiáng)度為0。其他方向的散射光強(qiáng)度與cos2θ成正比。

若入射光為非偏振光，其他條件不變，那么在任意位置的等離子體散射光強(qiáng)度IU為

由以上三個式子可看出，改變介質(zhì)折射率nmed、顆粒半徑α以及入射波長λ0等條件，均可測得不同的散射光強(qiáng)度。另外，隨著納米金顆粒的尺寸增大，消光中等離子體散射的比例也在增加［18］。

EI-Sayed及其合作者用完全米氏散射研究發(fā)現(xiàn)，對于20 nm的納米金，其總的消光系數(shù)幾乎全部來自于吸收，當(dāng)尺寸增加到40 nm，散射開始增加。當(dāng)尺寸增加到80 nm時，吸收和散射對消光系數(shù)的作用相似。這是因為對于大于20 nm的粒子，高能級電子振動開始起主要作用，光吸收和散射被認(rèn)為是多重振動［7］。以上研究可以指導(dǎo)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中納米金的選擇，比如，對于成像，首選具有高的散射特性的大粒子，而對于熱療，由于光主要被小粒子吸收且被有效轉(zhuǎn)換為熱能而可以用于組織損傷，因此首選小粒子。

1.2.2表面增強(qiáng)拉曼散射

拉曼散射是一種非彈性散射，對不同的分子振動能級敏感，它能夠提供目標(biāo)分子特有的結(jié)構(gòu)信息，因此拉曼光譜被稱為物質(zhì)的“指紋”。由于分子的拉曼截面積非常?。?0-30～10-25/分子［19］），要產(chǎn)生可被測量的拉曼散射信號至少需要108個分子。因此，普通的拉曼光譜不適合分析物分子鑒定和高靈敏度檢測。

在金屬納米顆?；蛘弑砻娲植诘慕饘匐姌O存在的情況下，拉曼散射信號強(qiáng)度可被大幅提高，這種現(xiàn)象被稱為表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface enhanced raman scattering，SERS）。SERS強(qiáng)度可以由下式表示［20］:

其中f2（λ0）和f2（λR）分別為激發(fā)波長和拉曼波長處的增強(qiáng)倍數(shù)，E為電磁場。SERS的增強(qiáng)機(jī)制有多種解釋，目前普遍被接受的主要有兩種:電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)。電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)均可用于分子與基底接觸的情況，但是后者不能用于分子與基底不接觸的情況。相比于電磁場增強(qiáng)，化學(xué)增強(qiáng)理論發(fā)展較為緩慢?；瘜W(xué)增強(qiáng)被認(rèn)為是分子吸附到金屬基底上后，拉曼截面積相比于傳統(tǒng)拉曼散射增大很多［21］。在化學(xué)增強(qiáng)模型中，電荷轉(zhuǎn)移模型被普遍接受。當(dāng)分子與基底接觸后，會形成金屬-分子的電荷轉(zhuǎn)移。如果激發(fā)光能量和電荷轉(zhuǎn)移的躍遷能級相同，金屬-分子體系會產(chǎn)生共振電荷轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生SERS效應(yīng)。

在電磁場增強(qiáng)機(jī)制中，拉曼散射信號的增強(qiáng)是由金屬納米顆粒表面的等離子體共振造成的而與分子性質(zhì)無關(guān)。納米顆粒的材質(zhì)和顆粒間的耦合程度不同時，增強(qiáng)的效果也會有所不同［22］。當(dāng)入射光的偏振方向平行于兩納米顆粒的連線時，金屬納米顆粒表面的電荷被極化，兩表面上的電荷相互作用產(chǎn)生極大的電磁場，在這個區(qū)域散射信號的增強(qiáng)效果最好，稱之為“熱點”。Xu等在理論上研究了納米顆粒的尺寸、入射波長、顆粒間距離對電磁場增強(qiáng)倍數(shù)的影響。在實驗中測得SERS信號的最大增強(qiáng)倍數(shù)為1014，僅通過電磁場增強(qiáng)機(jī)制計算的增強(qiáng)倍數(shù)最大為1011，這說明SERS信號可能是由電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)共同達(dá)到的效果。

SERS效應(yīng)可以由不同類型的金屬納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。例如，通過把納米金膠體溶液進(jìn)行沉積可以得到SERS效應(yīng)［23］。但是，這種SERS基底合成的化學(xué)方法存在兩個主要的缺點，第一，納米粒子結(jié)構(gòu)和SERS反應(yīng)不可重復(fù)，第二，相關(guān)的LSPR不容易調(diào)節(jié)到激勵波長。與此相反，納米平板印刷技術(shù)可以很好的控制沉積到基底上粒子的尺寸和形狀。從而可以對LSPR以及拉曼增強(qiáng)進(jìn)行精確控制［24，25］。

SERS的重要性在于其表面選擇性和高靈敏度，因此可以用來跟蹤分子［26］。

1.3與納米金相關(guān)的熒光特性

在臨床診斷中，基于熒光的陣列和檢測技術(shù)是靈敏度最高且最常用的生物檢測之一。在強(qiáng)光照射下納米金表現(xiàn)出極好的抗光漂白特性。在相對較高的激勵能量狀態(tài)下，除了量子產(chǎn)率低之外，納米金呈現(xiàn)了很強(qiáng)的原生熒光［27］。He等采用檸檬酸鈉法制備的納米金，激勵波長為514 nm和532 nm，在610nm波長左右獲得熒光。他們檢測的粒徑從16 nm到55 nm，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度隨著納米金顆粒的增大而增大。Abdelhalim等也對納米金的熒光特性進(jìn)行了研究［28］。他們購買了粒徑分別為10 nm，20 nm以及50 nm的三個粒徑的納米金，采用熒光光譜儀進(jìn)行掃描測量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)激勵波長為308 nm時，納米金在423 nm波長處獲得熒光。他們的結(jié)果表明，隨著納米金尺寸的增加，熒光強(qiáng)度減小。當(dāng)粒徑為50 nm時，幾乎測不到熒光，這與上述結(jié)果相矛盾。其原理可能是納米金的熒光與其周圍包裹的分子種類有關(guān)［29］。

分布于納米金表面或者其溶膠附近的熒光物質(zhì)，其熒光發(fā)射強(qiáng)度較之自由態(tài)熒光物質(zhì)的發(fā)射強(qiáng)度大大增強(qiáng)，這就是表面增強(qiáng)熒光。美國Maryland大學(xué)的Lakowicz教授領(lǐng)導(dǎo)的實驗室自1999年開始從理論和實驗兩個方面系統(tǒng)的研究了這一特殊的熒光現(xiàn)象，很快就獲得了令人振奮的結(jié)果［30，31］。他們發(fā)現(xiàn)將熒光物種置于粗糙金屬表面，可以增加該熒光物種的熒光量子產(chǎn)率，降低其熒光壽命，提高熒光物種的光學(xué)穩(wěn)定性。當(dāng)熒光物質(zhì)與金屬表面或者金屬粒子距離為5 nm＜d＜20 nm時，熒光發(fā)射得到增強(qiáng)，增強(qiáng)機(jī)理主要有兩種:1、由于表面等離子體共振使得局域電磁場增強(qiáng)從而使靠近基質(zhì)或者粒子表面上的分子活化，激發(fā)效率提高，從而增強(qiáng)了熒光輻射強(qiáng)度；2、激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)回到基態(tài)過程中，輻射衰減速率值增大，從而增加熒光輻射強(qiáng)度［32］。

然而，當(dāng)粗糙表面與熒光物質(zhì)距離小于5 nm時，激發(fā)態(tài)的熒光物會以非輻射的形式將能量傳遞給基質(zhì)并回到基態(tài)，表現(xiàn)為基質(zhì)對熒光發(fā)射的猝滅效應(yīng)。當(dāng)熒光素與納米金結(jié)合時，并且發(fā)射光譜與納米金等離子共振譜帶重疊時，就會發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，光漂白就會發(fā)生［33］。其輻射率和非輻射率都與粒子有關(guān)，已經(jīng)證明小粒子的漂白效率更高［34］。當(dāng)納米金粒子被作為能量轉(zhuǎn)移的受體時，這種效應(yīng)稱為納米表面能量轉(zhuǎn)移（Nanosurface energy transfer，NSET）。與FRET相比，NSET有兩個優(yōu)勢:首先，其可測量距離更長一些，大約為2倍多；其次，同一個粒子可以淬滅從可見到近紅外的不同發(fā)射頻率的染料。因此人們對于小于2 nm的納米粒子在生物納米技術(shù)中的應(yīng)用特別感興趣［35］。漂白熒光素的另一個過程是光致電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electon transfer，PET）到粒子上，這可以用金核的充放電模擬［36］。

熒光壽命是熒光測量中的一個重要參數(shù)，根據(jù)熒光壽命的不同即可獲得不同分子和物質(zhì)的信息。由于納米金有特別短的熒光壽命（大約50飛秒）［37］，因此將納米金與特殊分子結(jié)合可以用來檢測特異性物質(zhì)及分子。我們課題組通過特異性抗原抗體將納米金連接到腫瘤細(xì)胞上，通過熒光壽命成像可以明確區(qū)分出正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞［38］。其次，通過這種方法也可以進(jìn)一步確認(rèn)納米金是否穩(wěn)定地被結(jié)合到細(xì)胞上（未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。

2　基于納米金的生物分子檢測

2.1比色法

當(dāng)納米金顆粒相互接近或解離時，SPR吸收帶的位置會發(fā)生變化，這主要是由入射光引起的等離子體共振吸收造成的，利用這種性質(zhì)進(jìn)行分子檢測的方法叫做比色法。比色法分為目視比色法和光電比色法。相比于光電比色法，目視比色法一般不需要借助于其它的檢測儀器，能夠直接通過肉眼觀察反應(yīng)前后顏色的變化。納米金顆粒的團(tuán)聚有兩種作用機(jī)制，一種是粒子間交聯(lián)機(jī)制，另一種是非交聯(lián)機(jī)制［14］。

粒子間交聯(lián)機(jī)制利用交聯(lián)分子（Crosslinker molecules）和受體分子之間的結(jié)合克服排斥力，實現(xiàn)納米金顆粒的團(tuán)聚。這種方法通常需要將受體分子固定在納米金顆粒表面。最為經(jīng)典的例子是Mirkin小組首次研發(fā)的DNA探針，如圖3所示［11］。將分別與目標(biāo)DNA兩端互補(bǔ)的兩種DNA鏈連接到納米金顆粒表面，制成兩種納米金探針。加入目標(biāo)DNA后，DNA鏈的雜交使得納米金顆粒團(tuán)聚，溶液顏色呈現(xiàn)由紅到紫的變化。團(tuán)聚的納米金顆粒再次被分散開時，溶液會呈現(xiàn)出與團(tuán)聚時相反的顏色變化。Aslan等基于這種思路去檢測葡萄糖［3］，以Con A（伴刀豆球蛋白-A）作為交聯(lián)劑，使表面修飾有葡聚糖的納米金顆粒團(tuán)聚。加入葡萄糖后，葡萄糖占據(jù)Con A上所有的葡聚糖結(jié)合位點，團(tuán)聚的納米金顆粒分散開，溶液顏色由紫變?yōu)榧t色。類似的方法還被用于檢測腺苷［2］、蛋白質(zhì)［39］。這種方法也被用來檢測各種金屬離子，包括陽離子和重金屬離子。在金屬離子檢測中，通常都需要在納米金粒子表面結(jié)合螯合劑。當(dāng)所檢測的離子存在時，通過螯合配位體與螯合劑結(jié)合，就形成了多齒狀粒子間復(fù)合物從而會導(dǎo)致納米金的團(tuán)聚。通過在納米金表面修飾不同的化學(xué)基團(tuán)，同樣的方法也可以被用來檢測陰離子［40］。

圖3　納米金表面的寡核苷酸相互雜交引起團(tuán)聚的示意圖［11］Fig.3　Schematic representation of the concept for generating aggregates signaling hybridization of nanoparticle-oligonucleotide conjugates with oligonucleotide target molecules

另外一種粒子間交聯(lián)的思路是不再需要交聯(lián)劑，將受體與目標(biāo)分子分別修飾到納米金顆粒上，兩種類型的探針混合后出現(xiàn)團(tuán)聚，或者使通過此方法團(tuán)聚的顆粒再次分散［14］，通常會用到DNA的雜交或者裂解。非交聯(lián)機(jī)制中，納米金團(tuán)聚是由范德華力主導(dǎo)的，原因包括兩個方面:靜電穩(wěn)定性降低、空間穩(wěn)定性降低。Wei等利用適配子與目標(biāo)分子反應(yīng)后構(gòu)象變化誘導(dǎo)的納米金顆粒團(tuán)聚來檢測α-凝血酶［41］。

2.2納米金熱效應(yīng)應(yīng)用

由于納米金有很強(qiáng)的等離子體共振吸收效應(yīng)，因此納米金對一定波長的光具有強(qiáng)烈的吸收效應(yīng)，而且可以高效轉(zhuǎn)換為熱。又由于納米金粒徑小，傳熱快，因此激光照射后所引起的損傷范圍非常有限。這樣根據(jù)納米金的應(yīng)用方式的不同，可以造成納觀，微觀和宏觀三個尺度的損傷，從而對不同層次的生物分子和組織進(jìn)行操作。比如，宏觀應(yīng)用通常指組織主要是腫瘤的光熱治療，包括直接的光熱消融［42］，光熱作用提高藥物的靶向及釋放［43，44］，或者光熱作用提高放療的療效等［45］；微觀應(yīng)用主要指對單個細(xì)胞的消融，脂質(zhì)體的釋放及藥物的穿膜遞送［46-48］等；納觀應(yīng)用則包括對細(xì)胞膜納米級穿孔［49］，DNA快速消融［50］，納米金可控釋放藥物［51］，選擇性蛋白質(zhì)失活以及DNA等分子手術(shù)［52］等。近年來我們課題組在微觀熱效應(yīng)和納觀熱效應(yīng)方面進(jìn)行了一定的研究。利用納米金的光熱效應(yīng)，我們對蛋白質(zhì)進(jìn)行了滅活［53］，并發(fā)現(xiàn)其熱效應(yīng)僅限制一個抗體，及大約15 nm范圍內(nèi)。在此基礎(chǔ)上，我們將納米金通過抗原抗體靶向到特異性細(xì)胞上，在控制包括納米金的尺寸，納米金的數(shù)量以及激光能量，脈寬等參數(shù)下，既可以使細(xì)胞膜產(chǎn)生暫時通透性，并不影響細(xì)胞活性［47，54］；也可以使細(xì)胞達(dá)到足夠損傷從而造成死亡［55］。并且，我們通過不同的方法觀測評估納米金造成細(xì)胞膜損傷的范圍，建立不同模型研究其機(jī)理。

通常，納米金的成像技術(shù)一般都基于散射，輻射和吸收。而利用納米金的光熱效應(yīng)也可以用來進(jìn)行成像進(jìn)而進(jìn)行檢測。當(dāng)使用脈沖激光照射納米金時，納米金表面溫度會升高，從而導(dǎo)致其周圍局部的折射率發(fā)生變化并能被測量。這種技術(shù)可以用來觀測單個細(xì)胞內(nèi)納米金的分布，從而可用于檢測特異性的細(xì)胞［56］。

2.3等離子體散射應(yīng)用

相比于等離子體共振吸收的研究熱度，基于等離子體散射性質(zhì)的傳感器報道的較少。當(dāng)入射光波長與SPR吸收波長相當(dāng)時，不僅會有光的吸收，也會產(chǎn)生光的共振散射。越多的偶極子耦合，共振散射的強(qiáng)度越大。Kadir等搭建了一個簡單的系統(tǒng)，如圖4所示，通過檢測納米顆粒-Con A復(fù)合體結(jié)構(gòu)變化引起的散射光變化來確定葡萄糖的濃度［57］。以白色LED做為光源照射樣品，在與入射光呈90°的方向放置單色器檢測散射光。分別測量560 nm和680 nm波長處散射光的強(qiáng)度，得到強(qiáng)度之比，就可得到葡萄糖的濃度。他們通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種基于散射光強(qiáng)度比率的檢測方法不受納米金顆粒的濃度和光源及單色器的波動漂移影響。Kadir等還利用散射光空間分布的變化來檢測納米金顆粒的團(tuán)聚程度［28］。20 nm的納米金膠體在523 nm和650 nm水平偏振激光照射下，它的散射光空間分布與cos2θ成正比關(guān)系（如式3所示），在鏈霉親和素誘導(dǎo)下團(tuán)聚時，散射光的空間分布不再遵循瑞利理論，而是大部分呈現(xiàn)出前向散射的現(xiàn)象。

圖4　基于依賴波長的散射光比率的葡萄糖檢測系統(tǒng)示意圖［57］Fig.4　Experimental setup for wavelength-dependent ratiometric-scattering based glucose sensing

以上這些方法不受納米金顆粒濃度的影響，這是動態(tài)光散射（Dynamic light scattering，DLS）和其它散射光技術(shù)所不具備的優(yōu)點。傳統(tǒng)的吸收光譜測量技術(shù)，需要在很大的波長范圍內(nèi)掃描，而基于納米金散射光角度比率的方法，只需要獲得某一波長的入射光在兩個角度的散射光強(qiáng)度。此外，Wang等利用納米金顆粒的等離子體共振散射檢測尿液中的卡那霉素［58］。在加入可增強(qiáng)等離子體共振散射的尿素后，卡那霉素的濃度檢測范圍擴(kuò)展到2～800 nmol/L。

由于不同形狀尺寸的納米金其共振散射峰值不同，采用白光對納米金進(jìn)行照射，在暗場顯微鏡下可以觀察到不同形狀和尺寸的納米金發(fā)出不同顏色的光，即散射出不同波長的光。利用這個原理，讓不同形狀和尺寸的納米金結(jié)合不同的配體，就可以同時檢測多種不同的物質(zhì)。

2.4SERS應(yīng)用

納米金顆粒具有強(qiáng)烈的表面等離子體共振特性，可大幅增強(qiáng)拉曼散射信號，因此納米金被廣泛應(yīng)用于SERS光譜檢測技術(shù)。Keipp等利用基于納米金SERS效應(yīng)的生物探針檢測活細(xì)胞區(qū)域的局部PH值［59］。Qu等將氧化的Cyt c修飾到納米金顆粒上，通過檢測細(xì)胞內(nèi)被還原的Cyt c的SERS光譜確定超氧陰離子基團(tuán)的濃度，超氧陰離子基團(tuán)的檢測極限可達(dá)1.0×10-8mol/L［60］。最近，Kang等研發(fā)出一種金納米球-線結(jié)構(gòu)的SERS感應(yīng)平臺來檢測多種病原體的DNA［61］。金納米線和金納米球上分別修飾有探針DNA和帶有拉曼染料的報告DNA，加入目標(biāo)DNA后，通過DNA鏈的雜交完成兩種金納米顆粒的自組裝。這種球-線結(jié)構(gòu)的SERS探針可檢測的DNA濃度最低為10 pmol/L。Mirkin等分別用蛋白質(zhì)配體及拉曼染料和抗體及拉曼染料修飾納米金顆粒，在蛋白質(zhì)微陣列上實現(xiàn)蛋白質(zhì)-小分子和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的多元篩選［62］。Wang等利用抗原-抗體之間的相互作用使得兩種不同形態(tài)納米金顆粒進(jìn)行可控的組裝，結(jié)合SERS光譜檢測特定的蛋白質(zhì)［63］。將抗體片段及拉曼活性染料分別修飾到金納米球和金納米棒上，得到兩種SERS納米顆粒。在加入靶蛋白后，納米顆粒會組裝成圖5中所示的形態(tài)，顆粒表面的等離子體相互耦合從而增強(qiáng)拉曼散射信號。此外，基于SERS的金納米探針還被用于凝血酶［64，65］、蛋白酶［66］和堿性磷酸酶［67］等蛋白質(zhì)的測定。

2.5有關(guān)熒光性質(zhì)的應(yīng)用

將熒光物種置于粗糙金屬表面或超薄光滑金屬表面，使熒光物種的熒光發(fā)射性能獲得極大的改善［68，69］。這個特殊的性質(zhì)使其在DNA無損檢測中得到廣泛應(yīng)用。DNA分子的每個核苷酸殘基均包含一個具有紫外吸收的堿基，但實際上所觀測到的DNA分子熒光非常弱［70，71］，壽命也非常短（約10 ps）。將DNA分子置于粗糙金屬表面上，就有可能提高DNA分子的熒光強(qiáng)度，達(dá)到直接測定DNA分子的目的。與傳統(tǒng)的DNA分子檢測用標(biāo)記或探針技術(shù)不同，利用這一新技術(shù)可以實現(xiàn)對DNA分子的直接測定，不再需要引入外來物質(zhì)，真正實現(xiàn)非破壞性檢測。

基于納米金的熒光共振能量轉(zhuǎn)移經(jīng)常被用于檢測DNA、一些小分子和金屬離子。DNA特殊序列的檢測在臨床診斷，食品和藥品工業(yè)，以及病理、遺傳和環(huán)境的檢測中都起到了舉足輕重的作用。目前人們發(fā)展出通過用納米金標(biāo)記分子的基于發(fā)夾FRET系統(tǒng)的DNA檢測系統(tǒng)。如圖所示［72］:

核酸傳感器與有機(jī)染料結(jié)合并互補(bǔ)，在納米金上形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于FRET效應(yīng)，熒光被淬滅。當(dāng)DNA與目標(biāo)DNA進(jìn)行互補(bǔ)雜交時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)變化為棒狀結(jié)構(gòu)，染料的熒光就會增加。使用相似的原理，Nie等人證明末端帶有熒光素的單鏈核酸功能化的納米金可以組裝為受限的拱形結(jié)構(gòu)。在這個結(jié)構(gòu)中，由于供體和受體的距離接近熒光素被納米金有效淬滅。當(dāng)與目標(biāo)DNA連接時，受限的拱形結(jié)構(gòu)被打開，熒光素從納米顆粒上分離，重新獲得熒光。這種方法被用來檢測使用核酸酶后DNA的斷裂［35］。利用相似的原理，Mirkin等人還發(fā)展出用于檢測和定量分析細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的納米金傳感器，比如，細(xì)胞內(nèi)的mRNA［73］。Bai等人設(shè)計出基于納米金的FRET系統(tǒng)識別由G-四聯(lián)體穩(wěn)定的有機(jī)分子［74］。Fan等人報道了基于多色熒光納米金的分子標(biāo)記來檢測目標(biāo)分子的系統(tǒng)［75］。

圖5　基于通過抗原-抗體夾心裝配的納米金表面等離子體耦合增強(qiáng)（用粉色標(biāo)出）的SERS免疫檢測示意圖［63］Fig.5　Single-step SERS immunoassay based on plasmonic coupling enhancement（highlighted as pink corona）via sandwiched antibody-antigen assembly

圖6　染料-寡核苷酸-納米金結(jié)合體在與目標(biāo)DNA雜交前后的構(gòu)象變化Fig.6　Schematic illustration of DNA detection，showing the conformational changes of dye-oligonucleotide-AuNP conjugates before and after hybridization with the target DNA

基于納米金的FRET系統(tǒng)還可以用來檢測金屬離子和小分子。Murray及其合作者報道了基于FRET來檢測不同金屬離子的系統(tǒng)［76］。帶負(fù)電的硫普羅寧包裹的納米金與陽離子熒光素［Ru（bpy）3］3+通過靜電結(jié)合導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)把復(fù)合物加入電解液中時就會解離，從而熒光素的熒光恢復(fù)。目前這種方法已經(jīng)被用于檢測Hg2+離子［77］。Chang等人報道了最優(yōu)化的羅丹明B吸附的納米金系統(tǒng)對汞二價離子的選擇性比其他離子（Pb2+，Cd2+Co2 +）高50倍。Zhu及其合作者發(fā)展出采用二吡啶基苝橋納米金的基于FRET的銅離子傳感器［78］。最初納米金上的二吡啶基苝的熒光被淬滅，當(dāng)銅離子存在時，銅離子代替了納米金上的二吡啶基苝，從而熒光恢復(fù)。

除了用于檢測金屬離子外，基于納米金的FRET系統(tǒng)還被用于檢測有機(jī)小分子。Chang等人將尼羅紅非共價地結(jié)合在納米金粒子上用于檢測亞微摩爾水平的硫醇［79］。此外，Tang等人設(shè)計了一種基于FRET的膽固醇傳感器，其中使用的是β環(huán)糊精功能化的納米金［80］。納米金上的環(huán)糊精腔內(nèi)含有熒光素，由于FRET效應(yīng)，熒光被淬滅。當(dāng)存在膽固醇時，由于其具有更高的親和力，環(huán)糊精內(nèi)部的熒光素被膽固醇代替，從而熒光素的熒光恢復(fù)。這種方法可以檢測到納摩水平的膽固醇。

此外，由于小于1.2 nm的納米金本身具有很強(qiáng)的熒光特性，因此可以利用由于聚集而導(dǎo)致的熒光淬滅或者納米金的熒光增強(qiáng)來檢測金屬離子和蛋白質(zhì)［81］。

4　總結(jié)

獨特的光學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性、靈活的合成方法，是納米金應(yīng)用于生物分子檢測的優(yōu)勢。通過控制其形狀及尺寸，可以得到不同的光學(xué)性質(zhì)，比如SPR最大吸收峰位置，這在設(shè)計生物探針時可以為研究者提供較大的選擇范圍。基于比色法的納米金探針已經(jīng)被用于檢測核酸、蛋白質(zhì)、小分子及金屬離子，在臨床診斷、藥物遞送等領(lǐng)域有很大的發(fā)展?jié)摿?。目前一些已?jīng)被用于檢測的納米金比色反應(yīng)許多都是以紙質(zhì)做基底，例如早早孕檢測試紙，這為人們提供了一種便宜、低樣品量、一次性的便捷生物醫(yī)學(xué)檢測方式［14］。采用比色法的探針檢測極限通常在毫摩爾到幾十納摩爾之間?；诩{米金等離子體散射的檢測方法雖然報道的不是很多，但是它具有靈敏度高、易操作等特點，已經(jīng)被用于檢測氨基酸、生物分子和有機(jī)小分子［82］。納米金自身具有優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，是SERS檢測中理想的基底材料。這種表面光譜技術(shù)可在分子水平上研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，已在表面科學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)中發(fā)揮著日益重要的作用。相對于其他兩種檢測方法，SERS應(yīng)用更廣，而且靈敏度也很高，甚至能達(dá)到皮摩爾。而基于納米金有關(guān)的熒光性質(zhì)中，F(xiàn)RET是應(yīng)用最多的一種方法。主要用于檢測DNA，金屬離子等，但是其最高檢測濃度也是達(dá)到納摩水平。綜上所述，SERS目前是檢測靈敏度最高的一種方法，但是其儀器相對比較昂貴。比色法是最簡單的一種方法，對于精度要求不高的檢測，可以直接使用。納米金探針結(jié)合各種光譜技術(shù)在未來的生物檢測和醫(yī)學(xué)檢測中擁有巨大的發(fā)展?jié)摿?，將會提供更多更簡單快捷、更便宜、更精?zhǔn)的檢測方式。

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Gold Nanoparticles:Optical Properties and Implementations in Molecular Detection

YAO Cuiping，WANG Mengmeng，WANG Jing，ZHANG Zhenxi*
（Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，the School of Life Science and Technology，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，Shanxi，China）

Gold nanoparticles are one of the most widely studied nanoscale materials in recent years.It has great potential applications in area of bimolecular detection，diagnosis and therapy，due to their unique optical properties，facile surface chemistry，excellent biocompability and chemical stability.Especially，gold nanoparticles exhibit a unique phenomenon:strong surface plasmon resonance that lead to strong electromagnetic fields on the particle surface and consequently enhances all the radiative properties such as absorption and scattering.The scattering light intensity is extremely sensitive to the size and aggregation state of the particles，and the efficient conversion from light into heat by these gold nanoparticles can also be used for detection and therapy.Additionally，the main parameter of size-dependant optical properties of gold nanoparticles is the localized surface plasmon resonance（LSPR）known to generate a strong local enhancement of the electromagnetic field at the vicinity of the nanoparticles，this phenomenon is the basis of the surface enhanced Raman scattering.Furthermore，gold nanoparticles show excellent behavior of anti-photobleaching under the

presence of strong light illumination，its fluorescence lifetime imaging can be used to detect such as cancer cells using molecularly targeted gold nanoparticles.Gold nanoparticle-based enhancement fluorescence emission and fluorescience resonance energy transfer were also discussed.In this review，we cover these important optical properties of gold nanoparticels and address their recent application on bioprobe.

gold nanoparticles；optical properties；bio-molecule detection

TB383；O657.3

A

1007-7146（2015）04-0303-11

2015-05-11；

2015-06-12

國家自然科學(xué)基金項目（61108079，61120106013）；西安交通大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費（xjj2012133）資助

姚翠萍，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為生物醫(yī)學(xué)工程和生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)。（電子郵箱）zsycp@mail.xjtu. edu.cn

（電子郵箱）zxzhang@mail.xjtu.edu.cn