陳志輝，單睿陽，林鄭和，游小妹，鐘秋生，陳常頌（福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015）

利用SSR標記分析福建省選育福云半同胞系茶樹品種遺傳多樣性

陳志輝，單睿陽，林鄭和，游小妹，鐘秋生，陳常頌*
（福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015）

利用SSR分子標記技術對福建省選育的福云半同胞系茶樹品種遺傳多樣性進行研究。通過18對SSR引物PCR擴增13個參試品種，共獲得108條譜帶，其中多態(tài)性譜帶占67.59%。遺傳相似系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，半同胞系品種間相似系數(shù)在0.75～0.91之間，而對照種相似系數(shù)在0.68～0.97之間，說明對照種遺傳多樣性比半同胞系更豐富。13個參試品種聚類結果表明，早春毫等3個對照種與其它品種遺傳距離最遠，同時這3個品種由于相互間的遺傳距離較遠而沒有聚合成簇；剩余10個品種聚合成2組，其中5個半同胞系全部聚合于Ⅰ組，而母本福鼎大白茶與其它4個對照種聚合于Ⅱ組。從聚類圖中進一步看出對照種的遺傳多樣性比半同胞系豐富。通過分析聚類結果與遺傳相似系數(shù)發(fā)現(xiàn)遺傳距離與品種間的地理距離、品種的親本來源及品種性狀特征具有重要的相關性。茶樹遺傳多樣性分析為茶樹分子標記輔助選擇、茶樹雜交育種及遺傳改良提供依據(jù)，以及為茶樹栽培選種及引種提供指導作用。

福云半同胞系；遺傳多樣性；SSR分子標記

半同胞系是一種近親系，在林木品種遺傳改良與選育中被廣泛應用［1-4］。茶樹是我國重要的經(jīng)濟林木，對茶樹品種進行遺傳改良具有重要的生產(chǎn)應用價值。福鼎大白茶和云南大葉種是我國茶樹育種的重要骨干親本。據(jù)統(tǒng)計，我國育成的66個國家級茶樹無性系品種中，以福鼎大白茶為親本選育的品種或衍生品種有12個（占18.18%）；以云南大葉種為親本選育的品種或衍生品種有29個（占43.94%）［5-6］。福鼎大白茶與云南大葉種雜交后代表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢，是優(yōu)良的茶樹育種材料。福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所郭元超研究員利用福云系列的雜種優(yōu)勢，選育出多個國家級、省級茶樹品種。其中福云6號在福建、廣西、浙江有較大面積栽培，湖南、江西、四川、貴州、安徽、江蘇、湖北等省有引種，是當前全國推廣面積最大的人工雜交品種，為茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出了突出貢獻。

隨著生物技術的發(fā)展，分子標記技術在茶葉研究中得到廣泛應用，尤其在遺傳多樣性及親緣關系鑒定中使用最多［7-15］。分子標記技術經(jīng)歷了RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP等發(fā)展階段，其中SSR即簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR），因其具有重復性好、多態(tài)性高、共顯性、易于檢測和鑒別能力高等優(yōu)點，而被廣泛應用［16-20］。在分子標記技術不斷發(fā)展過程中，它的應用也從早期的茶樹種質(zhì)資源鑒定［21-26］逐步轉向分子標記輔助篩選、遺傳連鎖圖譜構建及QTL定位［27-29］等研究領域。本研究預期利用SSR分子標記技術，分析福建省選育的福云半同胞系茶樹品種的遺傳多樣性，為茶樹分子標記輔助選擇，茶樹雜交育種與遺傳改良提供根據(jù)，以及在茶樹栽培選種與引種中提供指導。

1 材料與方法

1.1 參試品種（見表1）

1.2 試驗方法

采用CTAB法提取茶樹基因組DNA。SSR反應體系、擴增程序及PAGE膠電泳檢測參考張成才等［18］的方法。

1.3 條帶統(tǒng)計及聚類分析方法

根據(jù)PAGE膠電泳膠圖統(tǒng)計條帶，對于同一引物的擴增產(chǎn)物，遷移位置相同的條帶記為1個位點，即擴增陽性（有較為清晰條帶出現(xiàn)）賦值為“1”，擴增陰性（無條帶或者弱帶）賦值為“0”，所得數(shù)據(jù)輸入Excel建立原始數(shù)據(jù)矩陣，待進一步分析。其中任一位點若有一個或一個以上個體不同于其他個體即為一個多態(tài)位點。以上所得數(shù)據(jù)按SHAN鄰接法對供試種質(zhì)資源進行UPGMA遺傳相似性聚類，并繪制樹狀聚類圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在NTSYS軟件系統(tǒng)下進行。

表1 參試品種及來源Table 1 Cultivars studied and their origins

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與電泳及譜帶統(tǒng)計分析

本試驗采用SSR分子標記技術研究福建省選育的福云半同胞系茶樹品種遺傳多樣性。實驗從40對SSR引物中篩選獲得18對擴增效果好，條帶清晰的引物，利用該批引物對13個參試品種進行PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳，在通過固定、銀染與顯色，最后進行讀帶與統(tǒng)計分析。SSR分子標記擴增效果見圖1，該圖所展示的是引物A134對13個參試品種擴增的譜帶情況。實驗共從18對SSR引物的電泳膠圖中獲得108條譜帶，平均每個引物擴增的譜帶數(shù)6條，其中73條有多態(tài)性，多態(tài)性程度為67.59%。條帶統(tǒng)計及聚類分析詳見材料與方法。

2.2 遺傳多樣性分析

福建省選育的福云半同胞系茶樹品種共有5個，即福云6號、福云7號、福云10號、福云595和福云20號，由福鼎大白茶（母本）與云南大葉種（父本，群體種）自然雜交，通過單株育種法選育而成。本實驗13個參試品種詳見表1，其中序號1、2、3、4、5為半同胞系茶樹品種，序號6為母本福鼎大白茶，實驗為了更好的呈現(xiàn)品種間的遺傳多樣性程度，隨機選取7個福建省選育的其它綠茶品種作為對照種。

圖 1 SSR引物A134對13個參試品種擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis on amplified products from 13 cultivars using SSR primers， A134

對參試品種的SSR分子標記實驗數(shù)據(jù)進行遺傳相似性及聚類分析發(fā)現(xiàn)，福云半同胞系各品種間的遺傳相似系數(shù)在0.75～0.91之間（見表2），其中福云6號與福云595遺傳相似系數(shù)最低（為0.75），相似系數(shù)最高為福云595與福云7號（為0.91）。從半同胞系聚類圖（見圖2a）可看出，5個半同胞系與母本可明顯分成2組，其中福云6號與福云10號聚于一組；福云7號、福云595、福云20號及母本福鼎大白茶聚成一組。

對隨機選取的7個對照種的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，7個對照種的相似系數(shù)介于0.68～0.97之間（見表2），其中相似系數(shù)最低為早春毫與福安大白茶以及早春毫與九龍大白茶，都為0.68，最高為福鼎大毫茶與九龍大白茶（為0.97）。通過比較半同胞系和對照種的相似系數(shù)可看出，半同胞系間的相似系數(shù)比較集中地分布于0.75～0.91之間，遺傳距離跨度較小，而對照種相似系數(shù)在0.68～0.97之間，跨度較大。盡管如此，半同胞系各品種間仍呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，從0.75～0.91的相似系數(shù)可看出，半同胞系各品種間的遺傳距離既不靠地太近也不離地太遠。這是由于親本福鼎大白茶與云南大葉種的遺傳距離較遠造成，2個親本不僅地理距離遠，而且生物學特征差異顯著，遺傳背景差異大，而雜交后代又各自遺傳了雙親的一半遺傳物質(zhì)，又具有較高的同源性，所以相似系數(shù)不會出現(xiàn)太高和太低的極端情況，0.75～0.91比較真實地呈現(xiàn)出本實驗半同胞系品種間較高的遺傳差異性。

對照種聚類結果分析發(fā)現(xiàn)（見圖2b），7個對照種沒有明顯的聚類成簇，相互間的遺傳距離比較均勻的間隔開，遺傳多樣性更豐富，遺傳距離跨度大，遺傳背景更為復雜，所以與對照種相比，半同胞系（見圖2a）的遺傳多樣性相對較低。

以上相似系數(shù)和聚類結果分析表明，半同胞系品種間具有較高的遺傳多樣性，但比對照種遺傳多樣性低。

圖 2 福云半同胞系（a）及對照種（b）聚類圖Fig. 2 UPGMA cluster analysis on Fuyun half-sib lines（a）and cultivars for comparison as control （b）

2.3 聚類分析

13個參試品種的遺傳相似系數(shù)及聚類結果（見表2，圖3），從圖3中可看出早春毫與所有品種距離最遠，其次是霞浦元宵茶，然后是福安大白茶。剩余的10個品種聚合成2組，其中5個半同胞系正好聚于Ⅰ組，即福云6號、福云10號、福云7號、福云595、福云20號。該5個半同胞系還可進一步分成a 與b兩個亞組，a亞組含有福云6號與福云10號，b亞組含有福云7號、福云595及福云20號。第Ⅱ組包含福鼎大白茶與4個對照種，分別為福鼎大白茶、歌樂茶、福鼎大毫茶、九龍大白茶和早逢春。

表2 13個參試品種的遺傳相似系數(shù)Table 2 Genetic similarity coefficient of 13 tested cultivars

圖 3 13個參試品種的遺傳相似性聚類圖Fig. 3 UPGMA cluster analysis on 13 cultivars

通過分析 13個參試品種的聚類圖以及品種間的遺傳距離，可看出其中有很強的規(guī)律性，特別與品種的發(fā)源地、品種的親本來源及品種性狀特征具有重要的相關性。

首先遺傳距離最遠的品種為早春毫，其次是霞浦元宵茶，然后是福安大白茶。其中早春毫為迎春自然雜交后代，而迎春是廣東鳳凰水仙群體種的后代，所以與其它參試品種的發(fā)源地都離得最遠（其它品種都來自福建省內(nèi)），聚類結果充分體現(xiàn)出遺傳距離與地理距離的高度相關性。另外2個品種霞浦元宵茶與福安大白茶，分別來自福建省內(nèi)的2個不同地方，相互間的地理距離也較遠。而剩余的10個品種中有9個品種來源地都與福鼎市相關，所以聚類結果呈現(xiàn)出遺傳距離與品種來源地極強的相關性，地理距離越遠遺傳距離越大，反之越小。同時這3個距離最遠的品種具有鮮明的品種特征，性狀獨特，與其它品種表型差異顯著，其中早春毫葉大芽壯，芽期早，形態(tài)特征與廣東鳳凰水仙相似，特別是葉形與其它參試品種差別明顯；霞浦元宵茶為特早生品種，幾乎是目前知道的芽期最早的品種；而福安大白茶葉大肥厚，芽肥壯，毫顯，混倍體，結實率極低。

剩余的10個品種聚合成2組，如圖3所示，其中所有參試的半同胞系全部聚于Ⅰ組，聚類結果進一步說明半同胞系的遺傳背景比對照種更為狹窄。Ⅰ組可進一步分成a，b兩個亞組，該聚類結果與5個半同胞系的表型特征相吻合，聚于a亞組的福云6號與福云10號在5個半同胞系中其形態(tài)特征最為接近，都屬于中小葉種，表型都偏向母本福鼎大白茶；b亞組中的福云7號、福云595及福云20號表型都偏向云南大葉種，屬小喬木型，葉子肥大，芽肥壯，樹形較高大。

第Ⅱ組包含福鼎大白茶與4個對照種（歌樂茶、福鼎大毫茶、九龍大白茶、早逢春）。以上5個品種除了九龍大白茶發(fā)源于福建省南平市松溪縣，其它4個品種都發(fā)源于福建省福鼎市，進一步說明發(fā)源地越近遺傳距離也越近。其中福鼎大白茶來源于福鼎市點頭鎮(zhèn)，小喬木型、中葉類、早生種；歌樂茶來源于福鼎市點頭鎮(zhèn)，小喬木型、大葉類、早生種；福鼎大毫茶來源于福鼎市點頭鎮(zhèn)，小喬木型、大葉類、早生種；九龍大白茶發(fā)源于南平市松溪縣鄭墩鎮(zhèn)，小喬木型、大葉類、早生種；早逢春來源于福鼎市桐城鎮(zhèn)，小喬木型、中葉類、特早生品種；以上品種都屬于毫多、芽壯、生長勢強的類型。但是遺傳距離最近的兩個品種卻不來自同一地方的品種，而是來自福鼎市的福鼎大毫茶與來自南平市的九龍大白茶。其相似系數(shù)高達0.97，同時這兩個品種外形也極為相似：葉大、芽壯、毫顯、生長勢強。但發(fā)源地距離卻較遠，其中原因可值得進一步研究，是否九龍大白茶來源于福鼎大毫茶的后代，或者它們有共同的親本來源。

從圖3中可看出，福鼎大白茶與其半同胞系沒有聚于一組，卻與發(fā)源地相同的品種聚在一起，說明福鼎大白茶遺傳背景與發(fā)源于福鼎市的品種更接近，與半同胞系遺傳距離更遠，這是因為半同胞系遺傳距離是介于福鼎大白茶與云南大葉種之間，而福鼎大白茶與云南大葉種屬于不同的生態(tài)型，遺傳距離遠，所以半同胞系與福鼎大白茶遺傳距離也離得較遠。

3 討論

3.1 福云半同胞系有較高的遺傳多樣性但低于對照種

一般來說 F1代的遺傳多樣性與父母本的遺傳距離相關，并介于兩親本之間。而父母本遺傳距離越遠，F(xiàn)1代的遺傳多樣性越豐富。半同胞系之間的遺傳多樣性則比同胞系間的遺傳多樣性更豐富，因為父本不確定，來源廣泛，遺傳背景復雜，所以半同胞系間的遺傳多樣性要高于同胞系，出現(xiàn)的遺傳變異更復雜，也為育種提供了更多的變異材料，更有可能選育出遺傳多樣性高、性狀優(yōu)異的品種。茶樹是異花授粉植物，本實驗的福云半同胞系，是福鼎大白茶與云南大葉種的天然雜交后代，父本云南大葉種屬于有性群體種，相比其它純粹自然雜交而來源各異的父本來說，云南大葉種的遺傳背景相對固定。通過SSR分子標記分析發(fā)現(xiàn)，福云半同胞系間具有較高的遺傳多樣性，遺傳距離在 0.75～0.91之間，但比對照種0.68～0.97要窄，這是因為對照種的親本來源各不相同，遺傳背景更復雜。但福鼎大白茶與云南大葉種由于地理距離遙遠，生物學形態(tài)差異顯著，遺傳距離遠，雜交后代顯示出極強的雜種優(yōu)勢，選育出多個國家級、省級品種。

3.2 分子標記技術在茶樹育種及栽培選種中具有重要的指導作用

通過分子標記方法分析茶樹品種遺傳多樣性及親緣關系，在茶樹育種中具有重要的利用價值，比如在農(nóng)藝性狀接近的育種材料中優(yōu)先挑選遺傳距離較遠的株系，同時在茶樹育種雜交組合的親本選配中也具有指導作用，選擇遺傳距離遠的品種作為雜交親本。另外，在茶樹栽培選種以及引種過程中也具有指導作用，不宜過多選擇遺傳距離相近的品種。為了提高當?shù)仄贩N遺傳多樣性，構建良好的種群生態(tài)系統(tǒng)，可多選擇遺傳距離遠的品種。

［1］ 韓創(chuàng)舉，楊培華，劉永紅，等.油松半同胞家系苗期生長性狀遺傳分析［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2008，36（05）：124-128，134.

［2］ 楊美寅，李文東，童方平，等.濕地松半同胞家系凈光合速率日變異規(guī)律研究［J］.中國農(nóng)學通報，2008，24（08）：171-176.

［3］ 馬萬俠，陳民生，宋尚文，等.苦楝半同胞家系苗期生長性狀的研究［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2010，41（01）：27-30.

［4］ 張宏斌，呂東，李秉新，等.青海云杉半同胞子代苗期生長性狀遺傳分析［J］.河北林果研究，2013，28（04）：335-338.

［5］ 葉乃興.我國茶樹育種的骨干親本及其系譜分析［J］.中國茶葉，2008，30（04）：11-13.

［6］ 余繼忠，黃海濤，姚明哲，等.基于EST-SSR的福云（半）同胞系茶樹品種（系）遺傳多樣性和親緣關系分析［J］.茶葉科學，2010，30（03）：184-190.

［7］ 劉振，王新超，趙麗萍，等.基于EST-SSR的西南茶區(qū)茶樹資源遺傳多樣性和親緣關系分析［J］.分子植物育種，2008，6（01）：100-110.

［8］ 喬婷婷，馬春雷，周炎花，等.浙江省茶樹地方品種與選育品種遺傳多樣性和群體結構的EST-SSR分析［J］.作物學報，2010，36（05）：744-753.

［9］ 王麗鴛，姜燕華，段云裳，等.利用SSR分子標記分析茶樹地方品種的遺傳多樣性［J］.作物學報，2010，36（12）：2191-2195.

［10］ 陳亮，楊亞軍，虞富蓮.應用 RAPD標記進行茶樹優(yōu)異種質(zhì)遺傳多態(tài)性、親緣關系分析與分子鑒別［J］.分子植物育種，2004，2（03）：385-390.

［11］ 劉振，姚明哲，王新超，等.基于 EST-SSR的福建地區(qū)茶樹資源遺傳多樣性和親緣關系分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42（05）：1720-1727.

［12］ 姚明哲，劉振，陳亮，等.利用 EST-SSR分析江北茶區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳結構［J］.茶葉科學，2009，29（03）：243-250.

［13］ 王麗鴛，劉本英，姜燕華，等.用 SSR分子標記研究茶組植物種間親緣進化關系［J］.茶葉科學，2009，29（05）：341-346.

［14］ 姚明哲，陳亮，馬春雷，等.ISSR和EST-SSR標記在檢測中國、日本和肯尼亞茶樹品種遺傳多樣性上的比較分析［J］.分子植物育種，2009，7（05）：897-903.

［15］ 周炎花，喬小燕，馬春雷，等.廣西茶樹地方品種遺傳多樣性和遺傳結構的EST-SSR分析［J］.林業(yè)科學，2011，47（03）：59-67.

［16］ 王讓劍，楊軍，孔祥瑞，等.福建15個茶樹品種SSR遺傳差異分析與指紋圖譜建立［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2014，29（10）：970-975.

［17］ 雷雨，段繼華，羅意，等.2011-15-3等4個茶樹新品系親緣關系的 EST-SSR分析［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，6（05）：1626-1632.

［18］ 張成才，劉園，姜燕華，等.SSR標記鑒定浙江省主要無性系茶樹品種的研究［J］.植物遺傳資源學報，2014，15（05）：926-931.

［19］ 張潔茹，韋朝領.基于4300DNA分析系統(tǒng)的茶樹SSR發(fā)掘方法優(yōu)化與建立［J］.茶葉科學，2014，34（05）：481-488.

［20］ 章志芳，馬建強.基于 SSR標記的茶樹新品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學，2012，（19）：1-4.

［21］ 王會，梁月榮，劉桂芹.早生優(yōu)質(zhì)茶樹品種資源篩選及RAPD分子標記分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2009，37（03）：177-179.

［22］ 段云裳，姜燕華，王麗鴛，等.我國茶樹主要骨干親本及其衍生品種（系）的 SSR分析［J］.植物遺傳資源學報，2011，12（04）：533-538.

［23］ 金基強，崔海瑞，龔曉春，等.用 EST-SSR標記對茶樹種質(zhì)資源的研究［J］.遺傳，2007，29（01）：103-108.

［24］ 晏嫦妤，黃華林，李家賢，等.利用 RAPD分子標記對 30份山茶屬種質(zhì)資源進行分類分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（16）：4962-4963，4968.

［25］ 王開榮，杜穎穎，李明，等.白化茶樹特異性RAPD分子標記研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2007，（01）：50-55.

［26］ 張毅，胡定金.EST-SSR分子標記在茶樹品種鑒別中的應用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51 （23）：5406-5408.

［27］ Ma， J. Q.， M. Z. Yao， C. L. Ma， et al. Construction of a SSR-based genetic map and identification of QTLs for catechins content in tea plant （Camellia sinensis）. PLoS One， 2014，9（3）：e93131.

［28］ Tan， L. Q.， L. Y. Wang， K. Wei， et al. Floral transcriptome sequencing for SSR marker development and linkage map construction in the tea plant （Camellia sinensis）. PLoS One，2013，8（11）：e81611.

［29］ Ma JQ， Huang L， Ma CL， et al. Large-Scale SNP Discovery and Genotyping for Constructing a High-Density Genetic Map of Tea Plant Using Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing （SLAF-seq）. PloS one 2015，10（6）：e0128798.

Genetic Diversity of Fuyun Half-sib Teas from Fujian Determined by Using SSR Markers

CHEN Zhi-hui，SHAN Rui-yang，LIN Zheng-he，YOU Xiao-mei，ZHONG Qiu-sheng，CHEN Chang-song*
（Tea research institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuan， Fujian 355015， China）

SSR markers were used to determine the genetic diversity of the teas， Fuyun half-sib lines， from Fujian. Eighteen pairs of SSR primers were applied for PCR amplification on 13 cultivars. There were 108 bands obtained， with 67.59% of polymorphisme. The genetic similarity coefficients of half-sib lines ranged from 0.75 to 0.91， while those of controls were between 0.68 and 0.97. Controls were richer in genetic diversity than the half-sib lines. The cluster of the 13 cultivars indicated onlya remote relationship with 3 controls， including Zaochunhao. The genetic distances among the 3 controls were also too large to be clustered in a same group. The remaining 10 cultivars were clustered into two groups， 5 half-sib lines in Group I and the female parent， Fuding dabaicha，with other 4 controls in Group II. The clustering results further confirmed a greater genetic diversity of controls as compared to the half-sib lines， and significant correlations between the genetic distance and the geographical separation， parental origin， and characteristics of the teas. The results provided information for the marker-assisted selection， cross-breeding， and genetic improvement on the tea， as well as a guide for tea cultivar selection and new variety introduction.

fuyun half-sib lines； genetic diversity； SSR molecular marker

S571.1

A

2015-09-16初稿；2015-11-03修改稿

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助（CARS-23）。

陳志輝（1975-），男，助理研究員，研究方向：茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail： chenzhihui75@sina.com

陳常頌（1973-），男，副研究員，研究方向：茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail： ccs6536597@163.com