宋振碩，王麗麗，陳鍵，楊軍國，張應(yīng)根，陳林（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

茶鮮葉萎凋過程中游離氨基酸的動態(tài)變化規(guī)律

宋振碩，王麗麗，陳鍵，楊軍國，張應(yīng)根，陳林*
（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

萎凋是影響白茶、紅茶和烏龍茶風(fēng)味品質(zhì)的重要工序。本文選用10份茶樹品種春茶新梢的一芽二、三葉和中小開面二至四葉為供試材料，在控溫控濕（20～22℃、RH 35%～45%）條件下，探討了不同萎凋程度茶鮮葉的游離氨基酸動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果表明，供試茶樣可按嫩度劃分為兩個類群，且在萎凋過程中均有按鮮葉減重率（0%、15%、30%、45%、60%）區(qū)分傾向，而使之區(qū)分的游離氨基酸特征組分主要有茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蘇氨酸和絲氨酸。隨著萎凋程度（鮮葉減重率）的加重，尤其是在減重率 30%以后，一芽二、三葉和中小開面二至四葉茶樣在二維空間的分布漸趨離散，即不同品種茶樣中游離氨基酸的組成模式愈加多樣。茶鮮葉各游離氨基酸在萎凋過程中的組分變化差異明顯，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸等游離氨基酸含量呈增加趨勢，而茶氨酸含量逐漸減少。該研究結(jié)果可為基于萎凋工藝的茶葉品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

茶鮮葉；萎凋；游離氨基酸；主成分分析

萎凋是白茶品質(zhì)形成的主要特征工序，也是紅茶和烏龍茶等多種茶類加工的初始工序。伴隨萎凋過程水分的逐步散失，茶鮮葉的生理結(jié)構(gòu)和理化特性將發(fā)生一系列復(fù)雜變化，并直接或間接影響茶葉的后續(xù)加工和制茶品質(zhì)［1-2］。游離氨基酸作為構(gòu)成茶葉品質(zhì)的重要成分，其組成、含量以及它們的降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均會影響茶葉品質(zhì)［3］。茶葉加工過程中，氨基酸不僅可以形成茶湯的鮮爽味，還可以通過脫氨反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、美拉德反應(yīng)等產(chǎn)生各種醇類和醛類香氣物質(zhì)［4-5］。茶鮮葉萎凋過程中溫度、濕度等環(huán)境條件是重要的影響因素，影響水分的散失速度、內(nèi)含物化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)度和程度，并最終影響風(fēng)味品質(zhì)成分的組成和含量［6-8］。自然條件下萎凋易受溫度、濕度的影響，導(dǎo)致其結(jié)果存在不確定性。為揭示茶鮮葉萎凋過程中游離氨基酸的變化規(guī)律，本研究借助空調(diào)、除濕機(jī)等設(shè)備進(jìn)行萎凋環(huán)境條件的設(shè)置，準(zhǔn)確調(diào)控萎凋溫、濕度條件下，選用10份茶樹品種的春茶新梢為供試原料，對兩種不同采摘嫩度茶鮮葉的萎凋失水情況進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測，并根據(jù)其萎凋減重率變化進(jìn)行取樣固樣，采用高效液相色譜法檢測分析18種游離氨基酸組分含量，明確萎凋過程中游離氨基酸組分的動態(tài)變化，以期為系統(tǒng)研究基于茶鮮葉萎凋失水管理的茶葉生化成分變化提供參考依據(jù)，對改進(jìn)萎凋工藝提高茶葉品質(zhì)具有較好的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮葉原料均采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園，采摘標(biāo)準(zhǔn)為春茶新梢一芽二、三葉和中小開面二至四葉。供試茶樹品種10份，分別是黃棪、梅占、白芽奇蘭、佛手、茗科1號（金觀音）、黃觀音、福建水仙、肉桂、大紅袍和矮腳烏龍。

Agilent Zorbax Eclipse-AAA HPLC柱、硼酸緩沖液、OPA試劑、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液［含有天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys），美國Agilent公司］，茶氨酸（99%，瑞士Adamas Reagent公司），γ-氨基丁酸（99%，美國sigma-aldrich公司），NaH2PO4、NaOH（分析純，上海國藥集團(tuán)），甲醇、乙腈（色譜純，美國sigma-aldrich公司），超純水（自制）。

1.2 主要儀器設(shè)備

色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）：Agilent 1260 高效液相色譜儀，配有G1311C四元泵、G1315D二極管陣列檢測器（DAD）；化學(xué)工作站：Agilent ChemStation B.04.03 ［52］。PB-21 標(biāo)準(zhǔn)型pH計（德國sartorius公司）；AL204電子天平（美國梅特勒-托利多集團(tuán)）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ACD-0502-U 實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（美國艾科浦國際有限公司），KF-35GW/35356格力空調(diào)（珠海格力電器股份有限公司），ROBO60T工業(yè)電熱風(fēng)機(jī)（上海固途工業(yè)品銷售有限公司），CH150D轉(zhuǎn)輪式除濕機(jī)（廣州市森井貿(mào)易有限公司），S520-EX溫濕度記錄儀（深圳市華圖測控系統(tǒng)有限公司），HAW-15AB計重電子天平（福州衡之展電子有限公司），G80F23CN2L-Q6（R0）格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試樣品制備

稱取茶鮮葉250 g，對其在控溫控濕（20～22℃、RH 35%～45%）環(huán)境條件下的萎凋失水變化進(jìn)行定時計量（每隔3 h稱重1次），計算萎凋葉的萎凋減重率，直至減重率達(dá)到約60%為止；對茶鮮葉（減重率0%）和萎凋葉（減重率為15%、30%、45%和60%）進(jìn)行微波［功率×?xí)r間：P-HI（火力）×60 s］、烘干（80℃、2 h）固樣。按照茶水比1 ： 150準(zhǔn)確稱取茶樣和量取純水于刻度試管中，沸水浴浸提60 min （30 min時搖動1次），浸提完畢后冷卻，搖勻過濾茶渣，然后過0.45 μm水膜待測。

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；柱溫：40℃；流動相：40 mM Na2HPO4pH7.8（A相）和ACN（乙腈）：MeOH（甲醇）：水（v/v/v）為45 ： 45 ： 10溶液（B相）線性梯度洗脫，洗脫程序：100%A（0 min）→100%A（1.9 min）→43%A（18.1 min）→0%A（18.6 min）→0%A（22.3 min）→100%A（23.2 min）→100%A（26 min），流速2 mL·min-1；DAD檢測波長338 nm；自動在線衍生化進(jìn)樣程序：吸取2.5 μL硼酸緩沖液→吸取0.5 μL樣品，混合，等待0.5 min→清洗針頭→吸取0.5 μL OPA，混合→清洗針頭→吸取32.5 μL水，混合→進(jìn)樣。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取0.200 g茶氨酸，置于10 mL容量瓶中加水定容，得濃度為20 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；準(zhǔn)確稱取γ-氨基丁酸0.020 g，置于10 mL容量瓶中加水定容，得濃度為2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；分別吸取1 μL茶氨酸和1 μLγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液加入到100 μL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（250 pmol·mL-1）制得母液，然后對母液稀釋成25 pmol·mL-1、50 pmol·mL-1、125 pmol·mL-1、250 pmol·mL-14個濃度梯度，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。取標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)自動在線衍生化后進(jìn)液相色譜分析，使用 Agilent ChemStation B.04.03 ［52］對各色譜峰進(jìn)行積分，獲得各峰的峰面積，以各種氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)，氨基酸進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2值。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后（公式 1）采用Multibase進(jìn)行主成分分析；采用SPSS 21.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸色譜圖分離效果與線性關(guān)系考察

在1.3.2中色譜分析條件下，對氨基酸混合標(biāo)樣（50 pmol·mL-1）與茶樣（以矮腳烏龍一芽二、三葉為代表）進(jìn)樣分析，同時測定18種游離氨基酸（見圖1）。從圖1中可以看出，整個分析運(yùn)行過程只需16 min，可以實(shí)現(xiàn)游離氨基酸的快速測定，分離的色譜峰峰型好，分辨率高。對氨基酸混合標(biāo)樣的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析，建立了18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（見表1）。從表1中可以看出，相關(guān)系數(shù)R2值均在0.9956～0.9999之間，在25～250 pmol·mL-1的濃度范圍內(nèi)，各種氨基酸的進(jìn)樣濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 供試茶樣中基于游離氨基酸組分的主成分分析

供試茶樣中游離氨基酸組分含量數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后進(jìn)行主成分分析（圖2）。從圖中可以看出，供試茶樣基本上可以劃分為一芽二、三葉和中小開面二至四葉兩個類群，可較好的進(jìn)行兩種不同嫩度區(qū)分，一芽二、三葉茶樣在二維空間的分布相對較為集中，而中小開面二至四葉茶樣則較為分散，表明不同嫩度茶鮮葉中的游離氨基酸組分存在差異。從主成分分析結(jié)果（表 2）可以看出，兩種采摘嫩度的茶樣類群劃分主要依據(jù)前3個主成分，其方差貢獻(xiàn)度分別為 85.8%（PC1）、4.6%（PC2）、3.6% （PC3），PC1主要與Thea、Asp、Glu等有關(guān)，PC2主要與Lys、Phe、Arg等有關(guān)，而PC3主要與Thea、Arg、Ser等有關(guān)。對這3個主成分的特征向量進(jìn)行加權(quán)平均綜合分析，一芽二、三葉區(qū)別于中小開面二至四葉的游離氨基酸特征組分主要是Thea、Asp、Glu、Arg、Thr和Ser，其權(quán)重累積達(dá)到83.1%。

圖 1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合樣和代表性茶樣的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms on amino acids of composited standard and tea extracts

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Curve of amino acids standard

表2 主成分分析結(jié)果Table 2 Results of principal component analysis shown in Fig. 2

圖 2 供試茶樣基于游離氨基酸組分的主成分分析Fig. 2 Principal component analysis based on free amino acids in teas

圖 3 一芽二、三葉茶樣基于游離氨基酸組分的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis based on free amino acids in teas made from a bud， 2ndand 3rdleaves

供試茶樣中游離氨基酸組分含量按兩種采摘嫩度分別數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理再進(jìn)行主成分分析（圖3、4）。從圖3中可以看出，一芽二、三葉茶樣在萎凋過程中主體呈單向展開趨勢，有按減重率（0%、15%、30%、45%、60%）區(qū)分傾向。從主成分分析結(jié)果（表3）可以看出，可用2個主成分來刻劃，方差貢獻(xiàn)度為86.5%（PC1）和4.2%（PC2），PC1主要與Thea、Asp、Glu等有關(guān)，PC2主要與Val、Lys、Thea等有關(guān)。對這2個主成分的特征向量進(jìn)行加權(quán)平均綜合分析，使一芽二、三葉茶樣按減重率相互區(qū)分的游離氨基酸特征組分主要是 Thea、Asp、Glu、Arg、Thr和Ser，其權(quán)重累積達(dá)到77.9%。

中小開面二至四葉茶樣在萎凋過程中主體也呈單向展開趨勢，有按減重率區(qū)分傾向（圖4）。從主成分分析結(jié)果（表4）可以看出，可用3個主成分來刻劃，方差貢獻(xiàn)度為82.8%（PC1）、5.8%（PC2）和5.1%（PC3），PC1主要與Thea、Asp、Glu等有關(guān)，PC2主要與Lys、Phe、Arg等有關(guān)，而PC3主要與Leu、Thea、Val等有關(guān)。對這3個主成分的特征向量進(jìn)行加權(quán)平均綜合分析，使中小開面二至四葉茶樣按減重率相互區(qū)分的游離氨基酸特征組分主要是Thea、Asp、Glu、Arg、Ser和Val，其權(quán)重累積達(dá)到80.9%。

隨著萎凋程度的加重，尤其是在減重率30%以后，一芽二、三葉和中小開面二至四葉茶樣在二維空間的分布都是越來越分散，不同品種茶樣中游離氨基酸組分含量的差異越來越大。

表3 主成分分析結(jié)果Table 3 Results of principal component analysis shown in Fig. 3

表4 主成分分析結(jié)果Table 4 Results of principal component analysis shown in Fig. 4

圖 4 中小開面二至四葉茶樣基于游離氨基酸組分的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis based on free amino acids in teas made from 2ndto 4thleaves on a banjhi bud

2.3 供試茶樣萎凋過程中游離氨基酸的動態(tài)變化

在控溫控濕萎凋過程中，萎凋葉中的游離氨基酸含量（以干質(zhì)量計）發(fā)生了顯著的變化（表5）。一芽二、三葉茶鮮葉萎凋過程中，游離氨基酸總量在萎凋減重率到45%時顯著增加，繼續(xù)萎凋至減重率到60%時略有減少；Thea含量呈減少趨勢，變化差異不顯著；Asp、Glu等游離氨基酸含量呈增加趨勢，Asp、His等變化差異不顯著，而Glu、Ser等游離氨基酸含量顯著增加，Glu在萎凋減重率到60%時又明顯減少；Val、Phe等在茶鮮葉中未檢出，而在萎凋過程中顯著增加。中小開面二至四葉茶鮮葉萎凋過程中，游離氨基酸總量呈增加趨勢，變化差異不顯著；Thea含量也呈減少趨勢，變化差異不顯著；Asp、Glu等游離氨基酸含量呈增加趨勢，變化差異不顯著，而含量相對較少的Ser、Thr等游離氨基酸含量顯著增加；Val、Phe等在茶鮮葉中未檢出，而在萎凋過程中顯著增加。兩種不同嫩度茶鮮葉在萎凋過程中，Thea、Glu等游離氨基酸變化趨勢基本一致，Tyr在一芽二、三葉茶鮮葉萎凋過程中呈減少趨勢，變化差異不顯著，在中小開面二至四葉中未檢出，而Leu在一芽二、三葉茶鮮葉萎凋過程中始終未檢出，在中小開面二至四葉茶鮮葉中未檢出，在萎凋過程中顯著增加。

由此可見，隨著萎凋程度的加重，萎凋葉中游離氨基酸含量變化差異明顯，Asp、Glu、Ser等多數(shù)游離氨基酸含量呈增加的趨勢，而Thea含量逐漸減少。

表5 茶鮮葉萎凋過程中游離氨基酸的變化Table 5 Changes on free amino acids in teas during withering（mg·g-1）

3 討論

多變量數(shù)據(jù)集在進(jìn)行主成分分析之前，常需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)權(quán)重/轉(zhuǎn)換。如果直接采用主成分分析這種最大化差異投影的方法，往往造成絕對數(shù)值大、變異較大的變量在模型擬合中的貢獻(xiàn)占主導(dǎo)地位，而絕對數(shù)值范圍小、變異小的變量對模型的貢獻(xiàn)也小。為了消除這種偏重，可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的權(quán)重或縮放［9］。主成分分析有多種權(quán)重方法，但是有關(guān)茶葉多種化學(xué)成分的數(shù)據(jù)預(yù)處理和模式識別目前尚無可靠的計量標(biāo)準(zhǔn)［10］。本文經(jīng)對比后使用數(shù)據(jù)未中心化的標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理方法，然后進(jìn)行主成分分析，可使后續(xù)視圖分類更為有效。

茶鮮葉在萎凋過程中，葉細(xì)胞組織逐步失水，細(xì)胞膜透性及相關(guān)酶活性增強(qiáng)，鮮葉中內(nèi)含成分發(fā)生水解、氧化，一些復(fù)雜的大分子貯藏物質(zhì)和部分結(jié)構(gòu)物質(zhì)分解成簡單的小分子物質(zhì)［11］。本文的萎凋過程中，游離氨基酸總量整體上呈上升趨勢，各游離氨基酸組分間變化差異明顯，Asp、Glu、Ser等主要游離氨基酸含量趨于增加，期間也會出現(xiàn)波動性減少，滑金杰等［8］的研究中整個萎凋過程中氨基酸總量緩慢上升，而在20℃萎凋過程中氨基酸總量也會出現(xiàn)一段下降的變化過程，主要因?yàn)椴桴r葉在萎凋過程中，不僅發(fā)生蛋白質(zhì)、多肽在蛋白酶和肽酶的作用下水解生成游離氨基酸［12］，而且游離氨基酸也被鄰醌氧化產(chǎn)生各種醇類和醛類香氣物質(zhì)［13］，游離氨基酸的增減主要依據(jù)在不同的加工階段哪種變化起主導(dǎo)作用。茶氨酸作為一種茶樹特征性非蛋白主體氨基酸在萎凋過程中呈逐漸減少趨勢，變化差異不顯著，可能是茶氨酸在水解酶的作用下發(fā)生了分解。萎凋過程中各游離氨基酸組分的增減變化相關(guān)性、其它生化成分的變化以及萎凋工藝如何控制還有待進(jìn)一步研究。

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Changes on Free Amino Acids in Fresh Tea Leaves during Withering

SONG Zhen-shuo，WANG Li-li，CHEN Jian，YANG Jun-guo，ZHANG Ying-gen，CHEN Lin*
（Tea Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fu'an， Fujian 355015， China）

Withering in tea processing significantly affects the flavor of white， black and oolong teas. The spring shoots （i.e.， a bud，2ndand 3rdleaves， or 2ndto 4thleaves on a banjhi bud） harvested from 10 tea cultivars were used in the experimentation. The withering chamber was controlled at 20～22℃ and 35%～45% RH. The changes on free amino acid contents in the tea leaves at various withering stages were monitored. The results showed that the leaf samples could be classified into two groups based on the maturity of the shoots. All teas prepared could be differentiated by their weight losses （i.e.， 0%， 15%， 30%， 45% and 60%） at different stages of withering. As the leaf weight decreased， changes were apparent on the typical free amino acids found in teas，including Thea， Asp， Glu， Arg， Thr， and Ser. Especially after the leaves lost 30% of their original fresh weight， the tea samples showed a significant spreading on the 2ndorder dimension distribution， indicating diversified amino acid compositions among different varieties of the teas during withering. There appeared a trend in increasing the contents of Asp， Glu and Ser， and declining in that of Thea as the withering progressed.

fresh tea leaves； withering； free amino acids； principal component analysis

TS272.7

A

2015-10-27初稿；2015-12-07修改稿

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXTD-1-1302）；福建省自然科學(xué)基金（2014J01097）；福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2014R1012-8）。

宋振碩（1984-），男，碩士，助理研究員，主要從事茶葉生物化學(xué)與綜合利用研究。E-mail： 274719459@qq.com

陳林（1975-），男，博士，副研究員，主要從事茶葉加工、茶葉生物化學(xué)及綜合利用研究。E-mail： chenlin_xy@163.com