畢亞男，李　震，周　昆，趙雪言，史　紅，鄭　林

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

·實驗研究·

補骨脂酚對小鼠肝功能和膽汁酸轉(zhuǎn)運體BSEP、NTCP的影響*

畢亞男1，李震2，周昆1，趙雪言1，史紅1，鄭林1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］觀察補骨脂酚對小鼠肝功能和膽汁酸轉(zhuǎn)運體膽鹽輸出泵（BSEP）、鈉牛磺酸膽酸共轉(zhuǎn)移蛋白（NTCP）的影響。［方法］小鼠連續(xù)14 d皮下注射50 mg/kg補骨脂酚和10 mg/kg α-雌二醇，分別在給藥1、3、7、14 d后處死部分小鼠取材，檢測血清生化，剖取肝臟稱質(zhì)量并進行肝臟病理組織學(xué)檢查，取新鮮肝臟用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測BSEP、NTCP的蛋白表達。［結(jié)果］補骨脂酚和α-雌二醇對小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。α-雌二醇皮下注射14 d會使小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALP）升高、肝臟腫大、肝系數(shù)升高，而補骨脂酚無此作用，但給藥期間補骨脂酚可導(dǎo)致血清ALP一過性降低，14 d時恢復(fù)正常。補骨脂酚對肝臟BSEP基本沒有影響，而會導(dǎo)致NTCP逐漸升高，給藥14 d時NTCP顯著高于溶劑組。給藥14 d，補骨脂酚組小鼠肝臟無病變，而α-雌二醇組小鼠肝臟存在肝細胞變性。［結(jié)論］50 mg/kg補骨脂酚給藥14 d未見肝臟毒性，而10 mg/kg α-雌二醇肝毒性明顯。

補骨脂酚；小鼠；膽鹽輸出泵；鈉?；撬崮懰峁厕D(zhuǎn)移蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.08

補骨脂酚是補骨脂中含量最高的成分，屬于單萜酚類成分在藥材中含量為1.12%～5.149%［1-2］，占揮發(fā)油的60%以上［3］，遠大于補骨脂素和異補骨脂素0.4%的含量水平［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)補骨脂酚對KH-2細胞有顯著毒性［6］，而課題組前期研究也表明補骨脂酚對HepG2細胞也有明顯毒性，自2005年開始有多起報道補骨脂引起的肝損害［7-9］，實驗室有結(jié)果顯示補骨脂對肝臟會造成損傷［10-13］，那么補骨脂酚是否會與補骨脂的肝毒性有關(guān)，報道中補骨脂引起的肝損害多有膽汁淤積的表現(xiàn)，可能與其影響了膽汁酸的轉(zhuǎn)運有關(guān)，這與雌激素引起的肝損害很相似［14］。本研究在ICR小鼠連續(xù)皮下注射給予觀察補骨脂酚對小鼠肝功能和肝臟中膽鹽輸出泵（BSEP，ABCB11）、鈉牛磺酸膽酸共轉(zhuǎn)移蛋白（NTCP，SLC10A1）表達的影響，并設(shè)了α-雌二醇作為陽性對照，初步考察補骨脂酚的毒性及其對膽汁酸轉(zhuǎn)運體是否有影響。

1　材料

1.1受試藥補骨脂酚，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）檢測純度＞95%，購自天津月牙湖科技有限公司。

1.2細胞ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。

1.3試劑與儀器α-雌二醇（TCI），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、膽汁酸（TBA）全自動生化儀檢測試劑盒（Biosino），BCA蛋白測定試劑盒（Beyotime），BSEP和NTCP試劑盒（Cusabio），1，2丙二醇（天津市江天化學(xué)技術(shù)有限公司），生理鹽水（辰欣藥業(yè)）。

Legend Micro17離心機為Thermo公司產(chǎn)品，7020全自動生化儀為日立公司產(chǎn)品，脫水切片機均為Lecia公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，InfiniteM200多功能酶標(biāo)儀為Tecan公司產(chǎn)品。

2　方法

2.1動物分組及給藥100只小鼠，按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，即對照組10只、溶劑組40只，補骨脂酚50 mg/kg組40只，α-雌二醇10 mg/kg組10只。參照文獻中雌二醇的給藥方式［14］，補骨脂酚和α-雌二醇在實驗前用溶劑（80%的1，2丙二醇生理鹽水液）進行溶解后供皮下注射使用。各組每日按5 mL/kg皮下注射給藥1次，對照組以飲用水灌胃，連續(xù)14 d。

2.2小鼠肝功能、病理組織學(xué)及BSEP和NTCP的檢測分別在1、3、7 d給藥結(jié)束，各取溶劑組和補骨脂酚組小鼠各10只進行實驗，剩余小鼠在給藥14 d后進行實驗。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，自眼眶取血，3 000 r/min離心分離血清，檢測血清中ALT、AST、ALP、TBA。取相同部位肝臟一葉，用12%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡下進行病理組織學(xué)檢查。取新鮮肝臟用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制備肝勻漿并檢測總蛋白濃度，將肝勻漿稀釋適當(dāng)倍數(shù)，參照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書，檢測小鼠肝臟中BSEP、NTCP蛋白濃度。

2.3統(tǒng)計學(xué)處理SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1補骨脂酚皮下注射不同時間對小鼠體質(zhì)量及肝臟的影響補骨脂酚和α-雌二醇連續(xù)給藥對小鼠體質(zhì)量沒有明顯的影響，補骨脂酚和α-雌二醇連續(xù)給藥14 d小鼠體質(zhì)量與溶劑組均無統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。連續(xù)給藥14 d，補骨脂酚對小鼠肝系數(shù)并無顯著影響，而α-雌二醇組小鼠肝系數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），見圖1。

表1　給藥不同時間小鼠體質(zhì)量的變化（±s）g

表1　給藥不同時間小鼠體質(zhì)量的變化（±s）g

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圖1　給藥14 d小鼠肝系數(shù)

補骨脂酚50 mg/kg連續(xù)給藥期間，小鼠血清中ALP有一過性降低，在給藥3 d和7 d均顯著低于溶劑組，14 d補骨脂酚組小鼠ALP與溶劑組并無統(tǒng)計學(xué)差異，而α-雌二醇10 mg/kg連續(xù)給藥14 d，可使小鼠血清ALP顯著升高。血清中AST、ALT和TBA的變化并不顯著，見表2-5。

連續(xù)給藥14 d，對照組小鼠肝細胞排列整齊，肝索清晰，肝細胞無變性壞死。溶劑組小鼠肝臟無明顯病理變化。補骨脂酚組小鼠肝臟肝索清晰，未見明顯病理改變，而α-雌二醇組小鼠可見肝臟的肝小葉中央?yún)^(qū)域肝細胞明顯腫脹變性、排列紊亂，見圖2。

圖2　給藥14 d典型病理照片（HE染色×200）

表2　給藥不同時間血清AST的變化（±s）U/L

表2　給藥不同時間血清AST的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 153.0±46.7166.5±40.6 165.8±44.0 214.2±44.9補骨脂酚組5010 153.5±41.5159.1±50.3 197.7±67.5 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表3　給藥不同時間血清ALT的變化（±s）U/L

表3　給藥不同時間血清ALT的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 31.2±05.2 50.3±29.1 38.9±14.4 214.2±44.9補骨脂酚組5010 30.5±10.8 34.6±09.6 35.9±05.9 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表4　給藥不同時間血清ALP的變化（±s）U/L

表4　給藥不同時間血清ALP的變化（±s）U/L

注：與溶劑組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---123.1±22.4溶劑組-10 168.6±56.1 130.3±31.7158.6±53.1 108.0±38.2補骨脂酚組5010 125.9±36.8 84.0±19.3**111.6±25.7*115.0±33.4 α-雌二醇組1010---252.9±50*

表5　給藥不同時間血清TBA的變化（±s）μmol/L

表5　給藥不同時間血清TBA的變化（±s）μmol/L

組別劑量n給藥時間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對照組-10---26.00±10.98溶劑組-10 21.88±4.70 19.23±9.64 23.64±13.70 30.02±21.00補骨脂酚組5010 19.43±8.78 22.41±9.99 17.27±6.29 22.63±14.20 α-雌二醇組1010---21.90±12.30

3.2補骨脂酚皮下注射不同時間對BSEP和NTCP的影響補骨脂酚50 mg/kg連續(xù)皮下注射14 d小鼠，小鼠肝臟中BSEP蛋白表達變化并不明顯，給藥1、3、7、14 d與溶劑組均無顯著差異；而NTCP蛋白表達隨著給藥時間的延長有升高的趨勢，給藥14 d時顯著高于溶劑組（P＜0.05），見圖3。

圖3　給藥不同時間肝臟BSEP和NTCP蛋白表達

4　討論

已經(jīng)有多個研究證實補骨脂酚在體外有十分明顯的細胞毒性，對于HepG2、A549、MCF-7、DU-145、THP-1等多個腫瘤細胞增殖有顯著抑制作用［15-17］，而在體內(nèi)卻基本沒有抗腫瘤研究報道，同時補骨脂酚的體內(nèi)安全性研究沒有報道，這可能是因為補骨脂酚的生物利用度很低的原因［18］。筆者沒有觀察到補骨脂酚對小鼠有明顯的肝毒性表現(xiàn)，有研究認(rèn)為補骨脂酚可以減輕四氯化碳（CCl4）等造成的肝損害［19］，但其保護機制尚不明了。

50 mg/kg補骨脂酚給藥14 d，沒有明顯影響B(tài)SEP，但NTCP卻顯著升高了。BSEP和NTCP是肝細胞膜上最重要的兩個膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白，BSEP將膽汁酸由肝細胞轉(zhuǎn)運至細胞間膽管，NTCP將膽汁酸從血液轉(zhuǎn)運至肝細胞，在非膽道系統(tǒng)出現(xiàn)機械性梗阻的情況下，這兩個轉(zhuǎn)運蛋白的變化很大程度上影響著血液和肝細胞內(nèi)膽汁酸的平衡，單純的NTCP升高可能致使肝細胞內(nèi)膽汁酸濃度異常升高。膽汁酸由肝細胞合成分泌，通過各級管道最終分泌到十二指腸，幫助進行脂肪消化，膽汁酸性極強，在細胞內(nèi)濃度過高可通過線粒體介導(dǎo)導(dǎo)致細胞凋亡，從而導(dǎo)致毒性產(chǎn)生［20］。補骨脂酚影響了小鼠肝臟內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)運體的表達，使肝細胞內(nèi)存在膽汁酸濃度過高的可能，但病理檢查并未發(fā)現(xiàn)病變，這可能是肝細胞膜上其他轉(zhuǎn)運體也同時發(fā)生改變，最終肝細胞內(nèi)膽汁酸處于一個比較穩(wěn)定的水平，也可能是因為補骨脂酚作用時間較短，未能體現(xiàn)出明顯毒性。

［1］Wang YF，Wu B，Yang J，et al.A rapid method for the analysis of ten compounds in Psoralea corylifolia L by UPLC［J］. Chromatographia，2009，4（28）：199.

［2］Qiao CF，Han QB，Song JZ，et al.Chemical fingerprint and quantitativeanalysisofFructusPsoraleaebyhighperformance liquid chromatography［J］.J Sep Sci，2007，30（6）：813-818.

［3］曹金一.補骨脂本草文獻與質(zhì)量研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2009：93.

［4］宋瀟，戚愛棣，王躍飛，等.不同炮制方法對補骨脂中4類化學(xué)成分的影響［J］．中國中藥雜志，2011，36（15）：2071-2075.

［5］姚三桃，楊濱，徐植靈.補骨脂中補骨脂酚的含量測定［J］.中國中藥雜志，1995，20（11）：681-683.

［6］李艾芳，沈國林，焦士勇，等.細胞色素P450介導(dǎo)的補骨脂酚代謝減毒［J］．北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，44（3）：431-436.

［7］Cheung WI，Tse ML，Ngan T，et al.Liver injury associatedwith the use of Fructus Psoraleae（Bol-gol-zhee or Bu-guzhi）and its related proprietary medicine［J］.Clin Toxicol，2009，47（7）：683-685.

［8］Nam SW，Baek JT，Lee DS，et al.A case of acute cholestatic hepatitis associated with the seeds of psoralea corylifolia［J］. Clin Toxicol，2005，43（6）：589-591.

［9］周昆，代志，柳占彪，等.補骨脂水提物引起的大鼠肝損害［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，32（4）：221-224.

［10］鄧平香，徐敏.補骨脂單味應(yīng)用和復(fù)方應(yīng)用對大鼠肝臟毒性的比較［J］.廣西中醫(yī)藥，2005，28（2）：49-50.

［11］譚沛，趙超，周昆，等.補骨脂灌胃30天對大鼠肝毒性的實驗研究［J］.新疆中醫(yī)藥，2010，28（2）：11-13.

［12］周昆，代志，柳占彪，等.壯骨關(guān)節(jié)丸中肝毒性藥材的篩選研究［J］.中國藥物警戒，2009，6（11）：641-648.

［13］常燕琴，朱家恩，白延斌，等.補骨脂對去卵巢大鼠體重及脂代謝的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（12）：2880-2881.

［14］Yamamoto Y，Moore R，Hess HA，et al.Estrogen receptor alphamediates17a-ethynylestradiolcausinghepatotoxicity［J］. J Biol Chem，2006，281（24）：16625-16631.

［15］Majeed R，Reddy MV，Chinthakindi PK，et al.Bakuchiol derivatives as novel and potent cytotoxic agents：a report［J］. Eur J Med Chem.2012，49：55-67.

［16］陳紅莉，馮慧瑾，李援朝.補骨脂酚的體外抗腫瘤活性及其關(guān)鍵中間體的合成研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：467-470.

［17］于悅，王亞靜，皮佳鑫，等.補骨脂酚研究進展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，37（2）：174-176.

［18］Yan DM，Chang YX，Wang YF，et al.In vivo pharmacokinetics of bakuchiol after oral administration of bakuchiol extraction in rat plasma［J］.J Ethnopharmacol，2010，128（3）：697-702.

［19］Park EJ，Zhao YZ，Kim YC，et al.Protective effect of（S）-bakuchiol from Psoralea corylifolia on rat liver injury in vitro and in vivo［J］.Planta Med，2005，71（6）：508-513.

［20］Palmeira CM，Rolo AP.Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids［J］.Toxicology，2004，203（1-3）：1-15.

Influence of Bakuchiol on liver function and bile acid transporters BSEP and NTCP in mouse

BI Ya-nan1，LI Zhen2，ZHOU Kun1，ZHAO Xue-yan1，SHI Hong1，ZHENG Lin1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the influence of bakuchiol on liver function and bile acid transporters in mice.［Methods］Mice were treated with 50 mg/kg Bakuchiol and 10 mg/kg-estradiol continuously for 14 d.At 1，3，7 and 14 d，mice were divided into several parts to kill.The material from mice killed was for serum biochemical indicators testing.Then mice livers were taken weight and carry on the liver histologic examination and take fresh liver to detect BSEP，NTCP protein expression with ELISA method.［Results］Bakuchiol and α-estradiol had no significant effect on body weight in mice.The subcutaneous injection of α-estradiol for 14 d made mice elevated serum ALP，hepatomegaly，liver coefficient increased，but the Bakuchiol didn't.ALP decreased for the time of the Bakuchiol injection，after 14 d back to normal.Bakuchiol had no effect on the liver BSEP mostly，and would result in higher NTCP gradually，for 14 d NTCP group was significantly higher than the solvent.After 14 d treatment，Bakuchiol groups of mice liver lesions，and α-estradiol group mice liver had cell degeneration.［Conclusion］Bakuchiol treatment for 14 d does not induce liver injury，but hepatotoxicity of α-estradiol is obvious.

Bakuchiol；mice；BSEP；NTCP

R285.5

A

1673-9043（2015）04-02222-04

國家自然科學(xué)基金項目（81202991）。

畢亞男（1987-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究工作。

周昆，E-mail：z.k.ken@263.net。

（2015-03-19）