楊賢，董利娟，祁偉△，程玉謙，呂星，梁帆

志賀菌屬外排泵AcrAB-TolC及其調(diào)控基因突變與氟喹諾酮耐藥性的關(guān)系

楊賢1，董利娟1，祁偉1△，程玉謙1，呂星2，梁帆3

目的 探討臨床分離耐氟喹諾酮志賀菌外排泵AcrAB-TolC基因及其調(diào)控基因marOR、acrR、soxS突變與耐藥性的關(guān)系。方法 使用K-B紙片擴(kuò)散法篩選臨床耐藥菌，測(cè)定加入泵抑制劑羰基氫氯苯腙（CCCP）后萘啶酸、左氧氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的最低抑菌濃度（MIC）的變化，PCR擴(kuò)增外排泵基因acrA、acrB及其調(diào)控基因marOR、acrR、soxS并測(cè)序。結(jié)果 159株志賀菌中共篩選出11株氟喹諾酮耐藥菌株；加入質(zhì)子泵抑制劑后2株耐藥菌株對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥的MIC下降；7株耐藥菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥的MIC不變；2株耐藥菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥的MIC上升。基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮耐藥菌株外排泵AcrAB-TolC調(diào)控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT堿基缺失。結(jié)論 泵抑制劑可部分抑制外排泵的活性。marOR突變可能與志賀菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥耐藥有關(guān)。

志賀菌屬；喹諾酮類；抗藥性，細(xì)菌；外排泵AcrAB-TolC；marOR；羰基氫氯苯腙

志賀菌屬是引起細(xì)菌性痢疾（菌?。┑闹饕≡?，是發(fā)展中國(guó)家引起感染性腹瀉的主要致病菌，在衛(wèi)生條件差的環(huán)境可能引起疾病暴發(fā)［1］。氟喹諾酮類抗菌藥作為人工合成藥物，具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，為治療菌痢的首選藥物。但隨著臨床的廣泛應(yīng)用，已有耐氟喹諾酮的志賀菌出現(xiàn)。本研究采用基因擴(kuò)增及測(cè)序技術(shù)，結(jié)合加入泵抑制劑前后耐藥菌最低抑菌濃度（MIC）的變化來(lái)探討外排泵系統(tǒng)在志賀菌耐氟喹諾酮類抗菌藥中的作用，以及外排泵調(diào)控基因突變對(duì)耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)菌株分離自2009年6月—2013年6月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市兒童醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院三所三級(jí)甲等醫(yī)院腸道門診就診患者的糞便，經(jīng)常規(guī)生化及志賀菌多價(jià)血清鑒定為志賀菌屬，共159株，并通過(guò)志賀菌單價(jià)血清鑒定明確血清型。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 DNA擴(kuò)增熱循環(huán)（PCR）儀（德國(guó)Eppendorf公司）、DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）。基因測(cè)序委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。高壓蒸汽滅菌器（山東安得醫(yī)療科技有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、超凈工作臺(tái)（冰峰）、1/10 000電子分析天平（MettlerAE100）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 志賀菌4種多價(jià)混合血清及分群血清均為寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。諾氟沙星、萘啶酸、氧氟沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。藥敏紙片包括氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明（SMZco）、頭孢哌酮、氯霉素、米諾環(huán)素和紅霉素共17種，購(gòu)自北京天壇生物制品研究所。泵抑制劑羰基氫氯苯腙（car?bonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP）購(gòu)自Sigma公司。水解酪蛋白（MH）瓊脂購(gòu)自上海伊華生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)參照參考文獻(xiàn)［2-3］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

Tab.1 PCR amplification primers and target fragments表1 基因擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗(yàn) 抗生素藥物敏感實(shí)驗(yàn)采用改良Kirby-Bauer（K-B）紙片擴(kuò)散法，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922［4］。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI/NC?CLS2012年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.4.2 血清鑒定 采用玻片凝集法，取一潔凈載玻片，兩側(cè)分別加一滴診斷血清及對(duì)照用生理鹽水。取新鮮培養(yǎng)菌落分別與血清及生理鹽水混合均勻，生理鹽水呈現(xiàn)均勻混濁，血清在1 min內(nèi)出現(xiàn)澄清透明、凝集顆粒較多為陽(yáng)性，反之為陰性。若對(duì)照出現(xiàn)凝集則考慮鹽水自凝。

1.4.3 志賀菌AcrAB-TolC及其調(diào)控基因的檢測(cè)與分析 煮沸法提取模板DNA。PCR擴(kuò)增體系25 μL，Premix taq酶12.5 μL，去離子水8.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)參見參考文獻(xiàn)［1］。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。分別取PCR產(chǎn)物15 μL以及相應(yīng)擴(kuò)增基因上游引物10 μL進(jìn)行純化與測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST程序與GenBank志賀氏標(biāo)準(zhǔn)菌片段序列進(jìn)行比對(duì)，分析其基因突變數(shù)量和突變位點(diǎn)。

1.4.4 DNA解旋酶（gyrA）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（parC）的檢測(cè) 檢測(cè)方法同1.4.3。

1.4.5 泵抑制劑干預(yù)實(shí)驗(yàn) 配制泵抑制劑CCCP（最終濃度為25 μg/L）與倍比稀釋不同濃度的抗菌藥物肉湯混合液，同時(shí)配制不含CCCP的不同濃度抗菌藥物肉湯混合液，每個(gè)濃度取100 μL放入96孔板中相應(yīng)孔內(nèi)，并設(shè)置僅含等濃度CCCP肉湯混合液孔作為生長(zhǎng)對(duì)照孔。將每株志賀菌制備成均勻懸液，經(jīng)0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)液比濁一致，吸取400 μL，加入39.6 mL 0.9%氯化鈉溶液中，混合均勻，用微量接種器接種后于36℃孵育18 h。比較應(yīng)用泵抑制CCCP前后菌株對(duì)抗菌藥物MIC值的變化，獨(dú)立重復(fù)4次。

2 結(jié)果

2.1 志賀菌血清學(xué)分型 159株志賀菌中宋氏志賀菌102株，福氏志賀菌57株。

2.2 藥敏結(jié)果 藥敏試驗(yàn)篩選出8株氟喹諾酮敏感菌株和11株氟喹諾酮耐藥菌株，耐藥菌株中耐萘啶酸11株、耐環(huán)丙沙星7株、耐氧氟沙星6株、耐諾氟沙星4株和耐左氧氟沙星2株。

2.3 志賀菌DNA解旋酶（gyrA）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（parC）的檢測(cè) 11株耐藥菌和8株敏感菌均擴(kuò)增出648 bp片段和469 bp片段，經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)為gyrA、parC基因，4株耐藥菌gyrA 83位突變（Ser→Leu）及parC 80位突變（Ser→IIe）；1株耐藥菌僅有parC（Ser→IIe），2株耐藥菌gyrA 205位苯丙氨酸缺失；4株耐藥菌gyrA和parC均未突變。

2.4 志賀菌外排泵基因及其調(diào)控基因的檢測(cè) 11株耐喹諾酮菌株中有1株基因缺失株，8株喹諾酮敏感菌株中4株基因缺失。因此，從10株耐喹諾酮類抗生素菌株和4株喹諾酮敏感菌株中分別擴(kuò)增出1 131、510、604、1 100和800 bp長(zhǎng)度的片段，見圖1。經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)為分別為acrA、acrB、marOR、soxS和acrR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，在耐藥組有10例，在敏感組中有4例?；驒z測(cè)結(jié)果acrA、acrB、acrR 和soxS突變率低，而在氟喹諾酮耐藥菌株中marOR都存在第36、37、38、39位CATT堿基缺失。

Fig.1 Electrophoresis of PCR products圖1 基因擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳

2.5 質(zhì)子泵抑制劑對(duì)氟喹諾酮類MIC的影響 2株耐藥菌和1株敏感菌對(duì)氟喹諾酮MIC下降，分別為1株耐藥菌對(duì)環(huán)丙沙星MIC由8 mg/L降為4 mg/L；1株耐藥菌氧氟沙星MIC由1 mg/L降為0.5 mg/L； 1株敏感菌對(duì)氧氟沙星的MIC由1 mg/L降為0.5 mg/L。2株耐藥菌對(duì)左氧氟沙星的MIC由2 mg/L上升為4 mg/L。7株耐藥菌株和7株敏感菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥的MIC不變。

3 討論

自1962年喹諾酮藥物人工合成以來(lái)便應(yīng)用治療菌痢，隨著臨床的廣泛應(yīng)用，志賀菌對(duì)此類藥物產(chǎn)生了耐藥性，耐氟喹諾酮藥物志賀菌的出現(xiàn)意味著對(duì)目前的經(jīng)驗(yàn)用藥治療策略提出挑戰(zhàn)［5］。志賀菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制是由于gyrA和parC的突變［6］，但外排機(jī)制在革蘭陰性菌的多重耐藥性中也起著重要作用［7］。志賀菌中的AcrAB-TolC外排泵屬于RND家族［8］，能外排青霉素、頭孢菌素、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、四環(huán)素、新生霉素、夫西地酸、唑烷酮類、利福平等抗菌藥，主要受acrR、marOR和soxS調(diào)節(jié)。臨床分離大腸埃希菌多重耐藥與marA過(guò)量表達(dá)有關(guān)，marA能上調(diào)多重耐藥泵的表達(dá)［9-10］。大腸埃希菌marA基因是marRAB的組成成分之一，它是固有多重耐藥的全局調(diào)節(jié)子，而且marA或marA類似調(diào)控因子在沙門菌、志賀菌、肺炎克雷伯菌、鼠疫耶爾森菌及其他腸桿科、奈瑟菌和金黃色葡萄球菌中廣泛存在［11］。marOR突變可使marA的轉(zhuǎn)錄去阻遏產(chǎn)生大量MarA，MarA與acrAB啟動(dòng)子附近DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子與RNA聚合酶的親和力，加快轉(zhuǎn)錄率產(chǎn)生大量的acrA和acrB，也以同樣的方式促進(jìn)TolC的表達(dá)，產(chǎn)生耐多藥細(xì)菌。本研究中11株氟喹諾酮耐藥株泵調(diào)控基因marOR第36、37、38、39位存在CATT堿基缺失，這與任靜朝等［2］報(bào)道相同。在加入泵抑制劑CCCP后，AcrAB-TolC缺失株MIC下降可能是由于菌株中存在AcrAB-TolC以外的質(zhì)子泵，而CCCP為廣譜質(zhì)子泵抑制劑，抑制其他質(zhì)子泵后MIC下降。存在AcrAB-TolC外排基因而MIC值無(wú)變化的菌株可能是泵基因未表達(dá)或外排泵活力低或外排泵對(duì)質(zhì)子泵抑制劑不敏感。2株耐藥菌分別對(duì)氧氟沙星和左氧氟沙星MIC值升高，與Ruiz等［12］報(bào)道相同，該研究對(duì)此現(xiàn)象的解釋為：當(dāng)大腸埃希菌AcrAB-TolC外排泵被抑制或失活時(shí)泵的外排底物如腸桿菌素、胱氨酸和嘌呤、半乳糖在細(xì)菌內(nèi)積累量增加，從而使AcrR失活和（或）soxS和marA表達(dá)增多，最終使acrAB過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致外排泵AcrAB-TolC外排作用增強(qiáng)，達(dá)到菌內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致MIC增高。本實(shí)驗(yàn)中受試菌株在加入CCCP后，僅少數(shù)菌株MIC值小幅度下降，大多數(shù)無(wú)變化甚至上升，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中受試菌株外排泵系統(tǒng)在氟喹諾酮耐藥機(jī)制中起的作用較小，其主要耐藥機(jī)制仍是gyrA和parC的突變。

外排泵基因acrAB在耐藥菌株中普遍存在，多數(shù)細(xì)菌具有主動(dòng)外排作用，CCCP能部分抑制細(xì)菌的主動(dòng)外排作用。本實(shí)驗(yàn)菌株MIC下降倍數(shù)不等，說(shuō)明主動(dòng)外排作用對(duì)菌株耐藥性產(chǎn)生的貢獻(xiàn)不同。

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（2014-06-18收稿 2014-11-20修回）

（本文編輯 魏杰）

Relationship of AcrAB-TolC efflux pump and its regulatory gene mutation with fluoroquinolones resistance by Shigella.spp

YANG Xian1，DONG Lijuan1，QI Wei1△，CHENG Yuqian1，LYU Xing2，LIANG Fan3
1 Second hospital of Tianjin Medical University Institute of Infectious Disease，Tianjin 300211，China；2 Tianjin Medical University General Hospital；3 Tianjin Children's Hospital
△Correspongding Author E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

Objective To investigate the role of AcrAB-TolC efflux pump in fluoroquinolones resistance by Shigella.spp and to explore the significance of AcrAB-TolC efflux pump on mutation of acrR，soxS and marOR as well as on drug re?sistence.Methods Drug resistant bacteria were selected by Kirby-Bauer disk diffusion test.After addition of efflux pump inhibitor carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone（CCCP），change of minimal inhibitory concentration（MIC）s of nilidixic acid，Levofloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin and Norfloxacin were examined.The DNA binding region of acrA，acrB，soxS，acrR and marOR gene in these mutants were amplified by PCR and sequenced.Results Among the 159 clinical isolates of Shigella，11 strains are resistant to fluoroquinolone.After the addition of CCCP，MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains decreased；the MICs of 7 fluoroquinolone resistant strains did not change；MICs of 2 fluoroquinolone resistant strains in?creased.The corresponding nucleotides C，A，T，T on the 36thto 39thof marOR gene were missing，showing by sequencing，in fluoroquinolone resistent strains which might be regulated by the efflux pump gene AcrAB-TolC.Conclusion Efflux pump inhibitor could restrain the activity of efflux partially.The mutations of marOR might play an important role in fluoroquino?lone resistent by shigella.

shigella；quinolones；drug resistance，bacterial；AcrAB-TolC efflux pump；marOR；carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone（CCCP）

R378.25

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.019

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染研究所（郵編300211）；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；3天津市兒童醫(yī)院

楊賢（1987），女，碩士在讀，主要從事志賀菌耐藥性方面研究

△E-mail：qiweiwyx@yahoo.com