劉婷婷，劉戈力△，趙菁，何娟，鮑鵬麗，丁曉明

肥胖SD幼鼠脂肪組織血紅素加氧酶-1表達與炎癥狀態(tài)和抗炎機制的探討

劉婷婷1，劉戈力1△，趙菁1，何娟1，鮑鵬麗1，丁曉明2

目的 探討肥胖SD幼鼠內(nèi)臟脂肪組織中血紅素加氧酶（HO）-1表達的變化及其與脂肪組織巨噬細胞浸潤、極化間的關(guān)系。方法 3周齡雄性SD大鼠24只，隨機均分為對照組和實驗組，分別給予標準飲食和高脂飲食，喂養(yǎng)至7周齡，檢測三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖及胰島素水平，定量PCR檢測腎周脂肪組織中HO-1、白介素（IL）-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1基因表達變化，F(xiàn)4/80、CD206免疫組化觀察脂肪組織中巨噬細胞浸潤和極化情況。結(jié)果 實驗組幼鼠已經(jīng)存在空腹血糖和胰島素升高，胰島素抵抗情況明顯，HO-1表達明顯高于對照組，炎癥因子IL-6、MCP-1基因表達明顯高于對照組，抗炎癥因子IL-10低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組巨噬細胞浸潤明顯多于對照組（P＜0.05），實驗組F4/80免疫組化平均光密度（MOD）值與CD206免疫組化MOD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 肥胖幼年SD大鼠的內(nèi)臟脂肪組織出現(xiàn)炎癥反應，伴有HO-1反應性的增加，后者影響巨噬細胞極化起到抗炎作用。

血紅素氧化酶（脫環(huán)）；脂肪組織；巨噬細胞；肥胖癥；大鼠，Sprague-Dawley

近年來，肥胖已成為危害兒童健康的一個重要問題，血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1作為肥胖研究領(lǐng)域中病生理機制關(guān)注的熱點，日益引起學者的重視。全身誘導的HO-1表達增加對成年小鼠營養(yǎng)性肥胖有明顯抗炎性保護作用［1］，但目前關(guān)于單純性肥胖的幼年個體體內(nèi)HO-1表達、炎癥狀態(tài)和抗炎機制研究的報道甚少。鑒于幼年和成年肥胖在起因、進程和結(jié)果上都存在差異［2］，探討幼年肥胖個體中HO-1表達與內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細胞浸潤和極化之間的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 3周齡雄性清潔級SD幼鼠24只，購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心。CFX-96型PCR儀（美國BioRad公司），高脂肪普通飼料（美國Research Diets公司），多聚甲醛（純度＞94%，美國Sigma公司），Trizol、MMLV（美國Invitrogen公司），F(xiàn)4/80、CD206的一抗以及鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）免疫組化二抗試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 動物模型建立 將24只3周齡雄性幼鼠按照隨機數(shù)字表法分成2組，每組12只，對照組給予普通飲食，實驗組給予高脂飲食。實驗期間，小鼠可自由飲水和攝食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃，濕度40%～50%，喂養(yǎng)至7周齡，處死后取腎周脂肪組織備用。

1.3 血生化指標測定 實驗4周末，禁食12 h后取尾靜脈血采用免疫比濁法檢測三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（FPG）及空腹胰島素水平（FINS），計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5。

1.4 脂肪組織中各基因表達水平測定 利用定量PCR測定2組SD幼鼠HO-1、白介素（IL）-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）的基因表達水平的差異。稱取100 mg新鮮腎周脂肪組織，經(jīng)Trizol處理，提取總mRNA，根據(jù)所選擇基因的相關(guān)信息，設計對應的引物序列。內(nèi)參GAPDH：上游5′-GACTGATGTTGTTGACAGCCACTGC-3′，下游 5′-TAGC?CACTCCTTCTGTGACTCTAAC-3′，產(chǎn)物153 bp；HO-1：上游5′-CACCTTCCCGAGCATC-3′，下游5′-AGCCTCTTCTGT?CACCCT-3′，產(chǎn)物 109 bp；IL-6：上游 5′-TTGCCTTCTT?GGGACTGATG-3′，下游5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′，產(chǎn)物100 bp；IL-10：上游5′-CAGTCAGCCAGACCCA?CAT-3′，下游5′-GGCAACCCAAGTAACCCT-3′，產(chǎn)物大小142 bp；MCP-1：上游5′-TTCCTCCACCACTATGC-3′，下游5′-GCATCAAAGGTGGAAGAATGG-3′，產(chǎn)物201 bp。運用Promega MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑進行逆轉(zhuǎn)錄反應。PCR擴增條件：反應體系20 μL，其中cDNA 1 μL，引物上下游各0.5 μL，SYBRgreenSupermix 10 μL，水8 μL。取0.5 μL RT產(chǎn)物放入PCR儀，PCR擴增條件：94℃，4 min；94℃，30 s；56℃，60 s；72℃，40 s；40個循環(huán)。用LightCycler Software Ver 4.0軟件分析目的基因的相對表達水平。

1.5 組織學分析 將取出的脂肪組織立即放入4%多聚甲醛，固定12 h，石蠟包埋切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色，無水乙醇分化及脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察2組脂肪組織中巨噬細胞浸潤。

1.6 免疫組化分析 石蠟切片常規(guī)脫蠟復水后，按照SABC免疫組化試劑盒步驟進行，經(jīng)DAB顯色后，封片，觀察巨噬細胞特異性標志物F4/80以及M2型巨噬細胞特異性標志物CD206在2組脂肪組織中的表達，分析脂肪組織中巨噬細胞的浸潤以及極化情況。采用Imagepro plus圖像分析軟件測量每張照片的陽性部位的總面積及總光密度值，計算平均光密度值（MOD）=總光密度值/總面積，棕褐色顆粒為陽性結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料均以±s表示，2組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血生化指標比較 實驗組FINS、FPG、 HOMA-IR、TG高于對照組，HDL-C低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05或P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparisons of sera indicators between two groups表1 2組血清檢測指標比較 （n=12，±s）

Tab.1 Comparisons of sera indicators between two groups表1 2組血清檢測指標比較 （n=12，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，表2、3同

組別對照組實驗組t FINS （mU/L）29.15±4.85 38.17±5.94 4.075＊FPG （mmol/L）4.18±0.57 5.74±0.48 7.252＊＊HOMA-IR 6.76±1.60 10.37±2.36 4.386＊HDL-C （mmol/L）1.08±0.24 0.79±0.15 3.550＊TG （mmol/L）1.57±0.17 2.09±0.24 6.125＊＊

2.2 2組脂肪組織中HO-1、IL-6、MCP-1及IL-10表達 實驗組中HO-1、IL-6和MCP-1表達高于對照組（P＜0.05），IL-10表達水平低于對照組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Gene expressions in adipose tissues of SD rats in two groups表2 2組SD幼鼠脂肪組織中各基因表達水平比較（n=12，±s）

Tab.2 Gene expressions in adipose tissues of SD rats in two groups表2 2組SD幼鼠脂肪組織中各基因表達水平比較（n=12，±s）

組別對照組實驗組t HO-1 4.23±2.82 11.56±3.08 3.511＊IL-6 0.56±0.32 2.13±0.81 4.763＊＊MCP-1 2.24±1.07 4.79±0.69 4.006＊IL-10 7.47±1.74 3.63±1.11 3.721＊

2.3 脂肪組織中巨噬細胞的募集 對照組幼鼠腎周脂肪組織HE染色示脂肪細胞形態(tài)正常，大小均一，可見少量炎性細胞浸潤，見圖1A。實驗組的脂肪細胞體積明顯增大，大小不等，脂肪細胞膜不完整，胞間可見大量多核細胞浸潤，見圖1B箭頭所示。

2.4 脂肪組織中巨噬細胞極化的免疫組化染色 實驗組脂肪組織F4/80、CD206可見大量散在和片狀融合的黃褐色顆粒沉積，明顯多于對照組，見圖2。實驗組F4/80、CD206高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組F4/80與CD206免疫組化MOD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Changes of average optical density values of F4/80 and CD206 in immunohistochemical analysis表3 F4/80、CD206的免疫組化圖像分析MOD的變化（n=4，±s）

Tab.3 Changes of average optical density values of F4/80 and CD206 in immunohistochemical analysis表3 F4/80、CD206的免疫組化圖像分析MOD的變化（n=4，±s）

組別對照組實驗組t F4/80 0.18±0.02 0.25±0.04 3.131＊CD206 0.12±0.03 0.24±0.05 4.116＊＊t 3.328＊＊0.312

3 討論

3.1 血脂和糖代謝異常 研究表明單純性肥胖兒童已有明顯的血脂代謝紊亂［3］和糖代謝異常［4］，兩者均是兒童心血管疾病的獨立危險因子。本研究顯示，高脂飲食喂養(yǎng)至7周的幼鼠的FINS、FPG、TG以及HOMA-IR明顯高于對照組，HDL-C低于對照組，表明幼年肥胖已經(jīng)導致了血脂和糖代謝異常狀態(tài)。研究表明，HO-1可以通過增加血漿脂聯(lián)素水平，改善血脂和血糖情況，緩解肥胖時的代謝情況［5］。脂肪組織中巨噬細胞和其他免疫細胞的累積和肥胖的慢性炎癥狀態(tài)相關(guān)，是導致胰島素抵抗的原因之一［6-7］。采用 HO-1誘導劑鈷原卟啉（CoPP）誘導增加HO-1表達，可以改善成年Zucker肥胖大鼠脂肪組織體積，減少脂肪組織的炎癥［1］。因此，針對幼年肥胖狀態(tài)下HO-1的研究，對于探討如何抑制體內(nèi)炎癥反應，改善胰島素抵抗和血脂異常情況，從而減少兒童心血管疾病的發(fā)生有重要意義。

3.2 HO-1和肥胖炎癥狀態(tài) 肥胖會伴有低度炎癥狀態(tài)，其特征是脂肪細胞肥大，激活的巨噬細胞和其他免疫細胞過度表達促炎癥因子［8］，這些炎癥因子促進巨噬細胞向脂肪組織中遷移，進一步加重局部的炎癥狀態(tài)。HO-1是血紅素分解的起始酶和限速酶，它能分解氧化物質(zhì)血紅素最終生成膽紅素、一氧化碳和鐵，這3種產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抗血管平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)血管張力等功能，對心血管系統(tǒng)起到重要的保護作用。人體中的HO-1可以被多種物質(zhì)或刺激因素誘導表達，如熱休克、重金屬、內(nèi)毒素、血紅素、氧化應激、輻射等。在本研究中，實驗組HO-1的增加可能與肥胖的炎癥和氧化應激狀態(tài)有關(guān)。同時實驗組幼鼠體內(nèi)的炎癥因子IL-6、MCP-1較對照組升高，表明幼年肥胖個體已經(jīng)存在低度炎癥反應?？寡装Y因子IL-10較對照組降低，考慮是中和炎癥因子的反應性降低。

3.3 HO-1和巨噬細胞及巨噬細胞極化 脂肪組織中的巨噬細胞來源于骨髓組織，其前體是單核細胞，是維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要細胞。在不同微環(huán)境下，巨噬細胞可以發(fā)生極化，可分為M1型即經(jīng)典活化的巨噬細胞（classically activated macrophage）和M2型即替代性活化的巨噬細胞（alternatively activated macrophage）。M1型巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6等炎癥因子，導致胰島素抵抗，而通常情況下，正常的體內(nèi)脂肪中的巨噬細胞主要以抗炎型M2為主，肥胖時的缺氧導致脂肪巨噬細胞向M1極化，并進一步導致內(nèi)臟脂肪組織的炎癥［9］。Tiwari等［10］研究發(fā)現(xiàn)使用高鐵血紅素誘導HO-1表達增加后，可以明顯促使小鼠心肌巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)變，同時減少炎癥因子的產(chǎn)生。Ndi?sang等［11］利用高鐵血紅素誘導小鼠體內(nèi)HO-1的升高，發(fā)現(xiàn)其促炎癥因子ED1的表達降低，而M2巨噬細胞標志物，如ED2、CD206、IL-10等明顯升高，表明HO-1升高能夠影響巨噬細胞極化，促使M1型向M2型轉(zhuǎn)變。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導的實驗組脂肪組織中HO-1表達較對照組增加，且巨噬細胞浸潤明顯增多，實驗組F4/80免疫組化MOD值與實驗組CD206免疫組化MOD值較對照組無明顯差異，表明巨噬細胞多數(shù)為M2型。在本研究中，保護性酶HO-1含量增加，但機體仍處在炎癥狀態(tài)的原因可能是，肥胖時巨噬細胞數(shù)目增多，炎癥狀態(tài)刺激HO-1表達增加，刺激巨噬細胞向抗炎型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎作用。但由于抗炎型和促炎型巨噬細胞數(shù)目均增多，來自實驗組的脂肪仍相對對照組存在炎性［12］。因此在幼年肥胖的早期，HO-1可能反應性增加，并可能通過促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的極化發(fā)揮抗炎作用，是肥胖早期機體對抗炎癥反應的一個保護機制。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠脂肪組織中浸潤的巨噬細胞多集中在脂肪組織中的血管間質(zhì)周圍，是否也存在對血管內(nèi)皮的影響及其導致血流動力學改變有待進一步研究。

綜上所述，幼年單純性肥胖已經(jīng)存在血脂和糖代謝異常，胰島素抵抗及炎癥狀態(tài)等代謝紊亂情況，成為心血管疾病的危險因素。在肥胖早期，肥胖狀態(tài)刺激體內(nèi)HO-1表達增加，并通過影響巨噬細胞極化起到抗炎作用。HO-1對巨噬細胞極化和浸潤的作用，將作為改善兒童期肥胖的一個新的靶點而逐步受到重視。

（圖1、2見插頁）

［1］Nicolai A，Li M，Kim DH，et al.Heme oxygenase-1 induction re?models adipose tissue and improves insulin sensitivity in obesity-in?duced diabetic rats［J］.Hypertension，2009，53（3）:508-515.doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.108.124701.

［2］Massiera F，Barbry P，Guesnet P，et al.A Western-like fat diet is sufficient to induce a gradual enhancement in fat mass over genera?tions［J］.J Lipid Res，2010，51（8）:2352-2361.doi:10.1194/jlr.M006866.

［3］Bao PL，Liu GL，Yang JY，et al.The relationgship between abdomi?nal fat and cardiometabolic risk factors among children［J］.Journal of Tianjin Medical University，2010，16（3）:509-511.［鮑鵬麗，劉戈力，楊箐巖，等.兒童腹型肥胖與心血管代謝危險因素關(guān)系的研究［J］.天津醫(yī)科大學學報，2010，16（3）:509-511］.doi:10.3969/j.issn.1006-8147.2010.03.041.

［4］Wang YL，Liu GL，Yang JY，et al.Study on the relationship be?tween levels of 2 h-PG and changes of islet β cell function and blood lipid in obese children［J］.Tianjin Med J，2013，41（2）:101-104.［王燕利，劉戈力，楊箐巖，等.肥胖兒童糖負荷后2小時血糖與胰島β細胞功能和血脂關(guān)系的研究［J］.天津醫(yī)藥，2013，41 （2）:101-104］.doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2013.02.002.

［5］Cao J，Peterson SJ，Sodhi K，et al.Heme oxygenase gene targeting to adipocytes attenuates adiposity and vascular dysfunction in mice fed a high-fat diet［J］.Hypertension，2012，60（2）:467-475.doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.112.193805.

［6］Ndisang JF.Role of heme oxygenase in inflammation，insulin-sig?nalling，diabetes and obesity［J］.Mediators Inflamm，2010，2010: 359732.doi:10.1155/2010/359732.

［7］Ndisang JF，Lane N，Syed N，et al.Up-regulating the heme oxygen? ase system with hemin improves insulin sensitivity and glucose me?tabolism in adult spontaneously hypertensive rats［J］.Endocrinology，2010，151（2）:549-560.doi:10.1210/en.2009-0471.

［8］Romeo GR，Lee J，Shoelson SE.Metabolic syndrome，insulin resis?tance，and roles of inflammation--mechanisms and therapeutic tar?gets［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（8）:1771-1776.doi:10.1161/ATVBAHA.111.241869.

［9］Fujisaka S，Usui I，Ikutani M，et al.Adipose tissue hypoxia induces inflammatory M1 polarity of macrophages in an HIF-1alpha-dependent and HIF-1alpha-independent manner in obese mice［J］.Diabetologia，2013，56（6）:1403-1412.doi:10.1007/s00125-013-2885-1.

［10］Tiwari S，Mishra M，Jadhav A，et al.The risk of heart failure and cardiometabolic complications in obesity may be masked by an ap?parent healthy status of normal blood glucose［J］.Oxid Med Cell Lon?gev，2013，2013:253657.doi:10.1155/2013/253657.

［11］Ndisang JF，Jadhav A，Mishra M.The heme oxygenase system sup?presses perirenal visceral adiposity，abates renal inflammation and ameliorates diabetic nephropathy in Zucker diabetic fatty rats［J］.PLoS One，2014，9（1）:e87936.doi:10.1371/journal.pone.0087936.

［12］Fjeldborg K，Pedersen SB，Moller HJ，et al.Human adipose tissue macrophages are enhanced but changed to an anti-inflammatory profile in obesity［J］.J Immunol Res，2014，2014:309548.doi: 10.1155/2014/309548.

（2014-07-14收稿 2014-11-11修回）

（本文編輯 魏杰）

HO-1 expression in adipose tissue of obese young SD rats and its role in inflammation and anti-inflammatory mechanism

LIU Tingting1，LIU Geli1△，ZHAO Jing1，HE Juan1，BAO Pengli1，DING Xiaoming2
1 Department of Pediatric，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail：liugeli2001@126.com

Objective To investigate the change of HO-1 expression in adipose tissue of obese young SD rats as well as its relationship with macrophage infiltration and polarization.Methods Three-week old SD rats（n=24）were randomly divided into 2 groups，routine diet group（NC）and high fat diet group（FC）.After feeding 4 weeks，triglyceride（TG），high den?sity lipoprotein（HDL-C），fasting glucose and insulin were compared between these two groups and the insulin resistance in?dex was calculated.The gene expressions of HO-1，IL-6，IL-10 and MCP-1 were assessed by quantitative PCR.Infiltration and polarization of macrophages and M2 macrophages in the visceral adipose tissue were examined by immunohistochemis?try.Results The levels of FINS，F(xiàn)BG and HOMA-IR in rats of FC group were higher than those of rats in NC group after 4 weeks feeding（P＜0.05）.The level of HO-1，IL-6，MCP-1 in rats from FC group were significantly higher while level of IL-10 were lower compared with those in rats from NC group after 4 weeks of feeding（P＜0.05）.In samples from FC groups，more macrophages were detected in adipose tissue by DAB staining than those from NC group.There was no significant dif?ference（P＞0.05）in MOD value of F4/80 and CD206 between these two groups（P＞0.05）.Conclusion The infiltration of macrophage in visceral adipose tissue of obese young SD rats significantly increased while HO-1 expression was reactively increased.This insinuated that HO-1 might play an important role in anti-inflammatory mechanism through regulating polar?ization of macrophages.

heme oxygenase（decyclizing）；adipose tissue；macrophages；obesity；rats，Sprague-Dawley

R725，R892.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.009

1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院兒科（郵編300052）；2天津醫(yī)科大學研究生院

劉婷婷（1987年），女，碩士，主要從事兒科內(nèi)分泌研究

△E-mail：liugeli2001@126.com