江偉凡，熊建華

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中最為常見的一種，90%以上的患者病情屬于膀胱移行細(xì)胞癌，且20%左右為浸潤癌。浸潤癌患者的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率相對較高，實(shí)際生存率較低，即使通過化療、放療、手術(shù)等方法對原發(fā)腫瘤與實(shí)體轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行治療，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者在5年內(nèi)的生存率也僅僅能夠達(dá)到5%左右。如何早期發(fā)現(xiàn)和診斷膀胱癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移是目前迫切需要解決的難題。本研究應(yīng)用免疫磁珠陰性富集技術(shù)結(jié)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（IME-FICC）檢測膀胱癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞儀方法（FCM）檢測膀胱癌患者外周血CD105、CD146，探索一種早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的方法。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2014年6月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科經(jīng)病理檢查證實(shí)的膀胱癌患者60例作為研究組，健康志愿者15例作為對照組。所有研究對象抽血前均沒有化療、放療及免疫等治療史，沒有其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史或同時合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史。按各自設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)分別納入研究對象。研究組中男46例，女14例；年齡35～77歲，平均年齡51歲；對照組中男9例，女6例；年齡34～52歲，平均年齡41歲。所有研究對象簽署知情同意書、并經(jīng)院倫理委員會討論通過。

1.2 研究方法

所有研究對象在入院后，晨起空腹?fàn)顟B(tài)下，采集7.5mL靜脈血于抗凝管中。留取血液標(biāo)本200μL，通過FCM檢測方式測定外周血CD105、CD146水平。剩余的血液標(biāo)本采用IME-FICC檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）。

1.2.1 IME-FICC檢測

采集的血液應(yīng)在48h內(nèi)完成CD45免疫磁珠陰性富集。

1）細(xì)胞分離：①去除血漿蛋白及脂類：將標(biāo)本轉(zhuǎn)至干燥的50mL離心管，離心后可見明顯分層，用電動負(fù)壓吸引器吸去上層清夜，保留含沉淀及余液7.5mL；②溶解紅細(xì)胞：依次加AS2及AS3液，離心2次后取上清液，保留余液（含白色沉淀）約5mL；③洗滌細(xì)胞：再次加AS1液，離心后保留余液（含白色沉淀）約1mL。

2）去除白細(xì)胞：取表面結(jié)合抗白細(xì)胞抗原（CD45）的抗體的磁珠顆粒進(jìn)行陰性富集。

3）細(xì)胞固定：將混勻的含細(xì)胞液加至已經(jīng)包被玻片的中央環(huán)加樣區(qū)，溫室靜置1～2h，用記號筆標(biāo)記細(xì)胞區(qū)，待玻片干燥后進(jìn)行染色或置于玻片盒-80℃保存。

1.2.2 細(xì)胞化學(xué)染色

1）打孔：將干燥玻片置于TBS液中5min，再將玻片置于0.1%TritonX-100中5min，目的是增加細(xì)胞通透性。2）抗原固定：將玻片用PBS清洗3次。然后浸浴于2%多聚甲醛中40min，目的是固定抗原，之后用TBS清洗3次，洗畢用濾紙吸去多余水分。3）抗體孵育：暗室中，在玻片上滴加抗CD45抗體／抗CK20／0.2%BSA熒光抗體。4）清洗：分別用0.2%BSA和TBS清洗3次。5）顯色：在細(xì)胞區(qū)內(nèi)加入7μL熒光計(jì)數(shù)液（含DAPI），最后加蓋玻片固定封片，之后即可在顯微鏡下計(jì)數(shù)或4℃保存（時間不超過3d）。

1.2.3 CTC的判定標(biāo)準(zhǔn)及陽性意義

1）形態(tài)學(xué)：①細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長型，細(xì)胞長徑大于10μm；②熒光下細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整；③光鏡下可見完整細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核。2）免疫熒光陽性標(biāo)準(zhǔn)：CK20+、CD45-、DAPI+。結(jié)果判定：由兩位經(jīng)培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)員在熒光顯微鏡下分別觀察細(xì)胞顯色情況，按照以上標(biāo)準(zhǔn)采集陽性細(xì)胞圖像、計(jì)數(shù)。3）陽性界定值：本課題以見到CTC，即≥1為陽性結(jié)果。

1.2.4 FCM檢測

1）取血液標(biāo)本200μL，各加入實(shí)驗(yàn)組和對照組流式管內(nèi)100μL，CD45、CD105及CD146抗體標(biāo)記，設(shè)同型對照組。2）破紅細(xì)胞膜依次加入破紅液A液600μL，及破紅液B液200μL，離心后，去上清液，剩余為有核細(xì)胞，加PBS緩沖液500μL，震蕩2s，使細(xì)胞混勻，待上機(jī)檢測。3）流式細(xì)胞儀測定：采用CD45設(shè)門方法獲取105個細(xì)胞，以CD45-CD105+CD146+細(xì)胞為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)目，判定結(jié)果。凡≥8判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組患者的外周血CK20、CD105／CD146陽性率均明顯高于對照組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 2組外周血CK20、CD105／CD146陽性率比較

3 討論

原發(fā)腫瘤發(fā)生脫離之后進(jìn)入到患者機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞是實(shí)體腫瘤在遠(yuǎn)處部位發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個必要條件[1]。血液循環(huán)系統(tǒng)中存在的腫瘤細(xì)胞具有與原發(fā)瘤細(xì)胞相同的細(xì)胞學(xué)和基因遺傳學(xué)特征[2]。從患者外周血經(jīng)過分離后得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞接種到試驗(yàn)小鼠機(jī)體之后可以在接種的部位和遠(yuǎn)隔器官產(chǎn)生轉(zhuǎn)移病灶，證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能[3]。

如何早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移是目前迫切需要解決的難題。近年來臨床上相關(guān)的腫瘤免疫學(xué)、腫瘤生物化學(xué)、酶學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)研究結(jié)果充分提示上皮性惡性腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期階段就可能有癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)中形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），即微轉(zhuǎn)移。因此如何準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

在人體血液中存在的大量各類血細(xì)胞相比較，脫落至外周血液中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目相對稀少，形態(tài)表現(xiàn)各異，分離、富集、鑒定難度較大。隨著近年來免疫磁珠、多色熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀等技術(shù)的發(fā)展，使得分離、富集血液中的腫瘤細(xì)胞成為可能[4]。免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS）是研究較多的新型免疫學(xué)技術(shù)的一種[5]。磁珠的富集方法可以分為正性富集和負(fù)性富集兩種類型，且各有優(yōu)劣[6]。本次研究中主要采用負(fù)性富集方式進(jìn)行，其基本原理是將患者血液中其他細(xì)胞除去，剩余細(xì)胞即為包含CTC在內(nèi)的全部稀有細(xì)胞，再對其實(shí)施鑒定。應(yīng)用負(fù)性富集方法富集的CTC不會受腫瘤細(xì)胞表達(dá)上皮抗原量多少產(chǎn)生的影響，只需將外周血中大部分白細(xì)胞去除。

外周血進(jìn)行富集之后的鑒定CTC的步驟是本課題的重要環(huán)節(jié)。臨床上對實(shí)體瘤CTC進(jìn)行鑒定的方法總體而言可以分為檢測核酸和細(xì)胞形態(tài)學(xué)辨別兩種。前者是對在腫瘤細(xì)胞和血液成分中差異表達(dá)的DNA或RNA情況進(jìn)行檢測；后者主要是采用細(xì)胞形態(tài)染色法或免疫細(xì)胞化學(xué)法對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本次研究中采用的是免疫熒光結(jié)合細(xì)胞形態(tài)的方法對CTC進(jìn)行鑒定，具體的評判標(biāo)準(zhǔn)為：CK20染色顯示為陽性，CD45染色顯示為陰性；細(xì)胞核DAPI顯示為陽性。

CK20是細(xì)胞角蛋白的一種，具有嚴(yán)格的上皮組織特異性，CK20在上皮源性的腫瘤中存在明顯的表達(dá)，而外周血、骨髓、淋巴組織中沒有任何表達(dá)。表達(dá)具有較高組織特異性，CK20是對腫瘤疾病進(jìn)行診斷的一個有價(jià)值的指標(biāo)。已經(jīng)播散到血液循環(huán)中的惡性腫瘤細(xì)胞仍然能夠繼續(xù)表達(dá)原組織細(xì)胞的特異性，故通過對外周血CK20表達(dá)情況進(jìn)行測定，即可對血液循環(huán)中膀胱腫瘤細(xì)胞的存在情況有充分的了解，對膀胱癌微轉(zhuǎn)移的判斷具有一定的幫助作用。

CD105對血管生成期間小血管內(nèi)皮細(xì)胞染色的敏感性較高，在腫瘤組織增殖狀態(tài)較為活躍的內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，但在大多數(shù)正常組織中沒有任何表達(dá)[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，直腸癌、乳腺癌等實(shí)性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清S-CD105的表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，從而提出血清S-CD105作為血管生成的標(biāo)志，可以用來預(yù)測惡性腫瘤患者疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。所以CD105高表達(dá)可以作為對惡性腫瘤病灶轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況進(jìn)行判斷的一個重要指標(biāo)。

CD146是Ca2+非依賴性細(xì)胞黏附分子的膜糖蛋白類物質(zhì)的一種，屬于免疫球蛋白超家族中的一個主要成員，對細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行介導(dǎo)，對局部黏連聚集、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞形態(tài)的維持及細(xì)胞游走和增殖的調(diào)控具有一定的幫助作用。目前臨床觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移需要腫瘤細(xì)胞能夠順利進(jìn)出血管系統(tǒng)，腫瘤中CD146陽性血管內(nèi)皮可以與腫瘤細(xì)胞上存在的CD146受體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，從而參與到腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管系統(tǒng)的過程中。另外由CD146介導(dǎo)形成的腫瘤細(xì)胞簇對腫瘤細(xì)胞間的作用和腫瘤細(xì)胞的生長可以產(chǎn)生一定的幫助[9]。有研究[10]結(jié)果表明CD146對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖、遷移過程具有促進(jìn)作用，充分提示其在血管新生過程中起重要作用。

本課題在已有的研究基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于腫瘤微轉(zhuǎn)移最新研究進(jìn)展，應(yīng)用IME-FICC檢測膀胱癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合FCM檢測膀胱癌患者外周血血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物CD105、CD146具有較高的敏感性。為膀胱癌微轉(zhuǎn)移的早期診斷提供新的思路和理論依據(jù)。

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