陳濤，謝黎明，唐海林

臨床研究

miR-451在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

陳濤，謝黎明，唐海林

目的研究miR-451在胃癌組織中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法收集胃癌組織標(biāo)本92例，癌旁正常組織47例，制成組織芯片。采用原位雜交技術(shù)檢測胃癌組織及癌旁組織中miR-451的表達(dá)情況，分析miR-451在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果miR-451在胃癌組織中的高表達(dá)率比癌旁正常胃黏膜組織明顯降低（38.04%vs 76.60%，χ2=18.503，P＜0.001）。Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者miR-451的高表達(dá)率低于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者（27.3%vs 54.1%，P=0.009），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中miR-451的高表達(dá)率亦低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（27.1%vs 57.6%，P=0.004），而不同年齡、性別、組織分化程度、T分期患者間miR-451高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miR-451高表達(dá)者總生存率明顯高于低表達(dá)者（69.2%vs 39.1%，P=0.003）。結(jié)論miR-451與胃癌的惡性轉(zhuǎn)變、浸潤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后明顯相關(guān)，可能是胃癌新的潛在診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

胃腫瘤；癌；預(yù)后；基因表達(dá)；原位雜交；miR-451

miRNA是一類長20～23 nt的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因3′非編碼區(qū)完全或不完全結(jié)合，從而抑制靶基因的翻譯或?qū)е耺RNA的降解而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能［1］。目前，在人類共發(fā)現(xiàn)有2 000多種成熟的miRNA，已證實(shí)miRNA參與多種重要生物學(xué)過程的調(diào)控，如發(fā)育、增殖、分化、凋亡，并且還參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。研究顯示miR-451在腫瘤中表達(dá)下調(diào)并類似于抑癌基因樣作用［3］。然而，目前對miR-451在胃癌中的表達(dá)及臨床意義的研究報(bào)道尚少。本研究通過原位雜交技術(shù)檢測miR-451在胃癌組織與癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)，探討miR-451與胃癌臨床分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)病機(jī)制并尋找新的診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本收集組織標(biāo)本來源于2005年3月—2011年9月南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院資源庫保存的胃癌石蠟標(biāo)本92例，癌旁正常組織標(biāo)本47例，制成組織芯片?；颊吣挲g31～78歲，平均（55±18）歲。術(shù)前均未做化療或放療等抗腫瘤治療。所有配對標(biāo)本癌組織經(jīng)HE染色證實(shí)均為腺癌，所取正常組織距癌緣＞5 cm，HE染色證實(shí)為非癌組織，均無腸上皮化生或上皮內(nèi)瘤變。

1.2儀器與試劑雜交爐購自英國HYBRID公司，恒溫水浴箱購自美國Pharmacia公司，原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德公司，miRNA-451探針序列由美國Exiqon公司合成。

1.3方法

1.3.1miR-451表達(dá)的檢測采用原位雜交法。烤片后切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇復(fù)水。3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶。3%胃蛋白酶室溫消化15～20 min，水洗后固定。滴加預(yù)雜交液，55℃預(yù)雜交2 h。地高辛標(biāo)記的miR-451探針55℃雜交過夜。次日用不同濃度SSC緩沖液洗滌。滴加封閉液室溫封閉30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h。滴加SABC液室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，充分水洗，中性樹膠封片保存。

1.3.2結(jié)果判定miR-1451呈棕黃色顆粒的陽性信號定位于胃黏膜上皮或胃癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中。對miR-451的信號強(qiáng)度進(jìn)行評估并賦予分值（0～4分）：0～≤1分為無，＞1～≤2分為弱信號，＞2～≤3分為中等信號，＞3～≤4分為強(qiáng)信號［1］。每個標(biāo)本于400倍顯微鏡分別選取3個具有代表性的視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞并計(jì)算miR-451陽性細(xì)胞所占百分比。表達(dá)得分等于信號強(qiáng)度×陽性細(xì)胞的百分比，最低為0，最大為4，＜2為低表達(dá)，≥2為高表達(dá)。組織芯片結(jié)果由2位病理醫(yī)師獨(dú)立鏡檢和評分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法。采用Kaplan-Meier生存曲線分析miR-451表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織中miR-451表達(dá)水平92例胃癌組織中miR-451低表達(dá)57例（61.96%），高表達(dá)35例（38.04%）；47例正常胃黏膜組織中miR-451低表達(dá)11例（23.40%），高表達(dá)36例（76.60%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.503，P＜0.001）。染色情況見圖1。

2.2miR-451在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者miR-451的高表達(dá)率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期胃癌患者（P= 0.009）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中miR-451的高表達(dá)率亦低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.004）。而不同年齡、性別、組織分化程度、T分期患者間miR-451高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3miR-451在胃癌組織中表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系對92例胃癌患者的親屬進(jìn)行電話隨訪，隨訪4～42個月。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，57例低表達(dá)者中死亡28例，病死率60.9%，而35例高表達(dá)者中死亡8例，病死率30.8%。生存分析顯示，miR-451高表達(dá)者總的生存率（69.2%）明顯高于低表達(dá)者（39.1%），表明miR-451表達(dá)越高的胃癌患者，其生存時間越長，預(yù)后越好（log-rank χ2=8.856，P= 0.003），見圖2。

Tab.1　The correlation between expression of miR-451 and its clinicopathologic parameters in patients with gastric cancer表1　胃癌患者miR-451高表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系　例（%）

Fig.2　Survival curve of miR-451 expression and clinical prognosis of patients with gastric cancer圖2　miR-451表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的生存曲線

3　討論

3.1miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制胃癌的發(fā)生是一個多因素、多階段、多步驟的病理發(fā)展過程，涉及一系列相關(guān)癌基因和抑癌基因的參與。近年來，miRNA成為分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。miRNA在不同類型的腫瘤中表達(dá)各異，而且表達(dá)異常的miRNA往往位于癌癥相關(guān)基因的突變位點(diǎn)。目前研究顯示影響miRNA在胃癌中表達(dá)異常的可能機(jī)制有：參與miRNA形成的蛋白因子異常［4］、DNA甲基化的狀態(tài)［5］以及miRNA所在基因發(fā)生缺失、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位［6］等。

3.2miRNA在胃癌中表達(dá)的臨床意義胃癌中有多種miRNA的表達(dá)，且不同表達(dá)水平患者的預(yù)后亦不同。Li等［7］對100例胃癌患者的miRNA表達(dá)譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌中l(wèi)et-7a、miR-10b、miR-126、miR-223、miR-21、miR-30a-5p、miR-338的表達(dá)可作為一個獨(dú)立的預(yù)測因子用于預(yù)測患者的總生存期和無病生存時間。Zhang等［8］研究顯示，在胃癌中miR-375高表達(dá)以及miR-142-5p低表達(dá)能預(yù)測胃癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率。研究表明，miR-200b和miR-200c在胃癌中低表達(dá)，且與胃癌患者的總生存期和無病生存時間相關(guān)，并且可能是一個能獨(dú)立預(yù)測胃癌患者生存的因子［1］，且miR-200b能抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖和侵襲［9］。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-200b 和miR-22在胃癌中低表達(dá)，并與胃癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［10］。

3.3miR-451在胃癌中表達(dá)的臨床意義研究表明，miR-451在肺癌［3］、肝癌［11］、食管癌［12］、膠質(zhì)瘤［13］、鼻咽癌［14］中表達(dá)下調(diào)，類似于抑癌基因樣作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明miR-451在這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。Liu等［15］通過將miR-451模擬物轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌RKO株和宮頸癌Hela細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制，而將miR-451模擬物轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）株中，該細(xì)胞的血管生成能力明顯下降，表明miR-451能抑制腫廇細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成能力。汪偉等［16］通過對18例胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織進(jìn)行研究顯示，miR-451在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌的分化程度相關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)miR-451在胃癌中的抑癌基因樣作用及相關(guān)臨床意義，本次研究通過原位雜交檢測了92例胃癌組織及47例癌旁正常組織，發(fā)現(xiàn)miR-451在胃癌組織中的高表達(dá)率較癌旁正常胃黏膜組織明顯降低，且miR-451在胃癌中的表達(dá)水平與胃癌患者的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-451在胃癌中表達(dá)下調(diào)與患者的不良預(yù)后亦相關(guān)。

（圖1見插頁）

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（2014-08-18收稿2014-10-30修回）

（本文編輯李鵬）

The expression of miR-451 and its clinical significance in gastric cancer

CHEN Tao，XIE Liming，TANG Hailin
Medical Service Center，The First Affiliated Hospital of University of South China，Hengyang 421001，China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-451 and its clinical significance in gastric cancer.Methods The miR-451 expression was detected in 92 samples of gastric cancer and 47 sapmles of normal stomach mucosa.The correlations of miR-451 expression with clinicopathologic characteristics，overall survival and disease-free survival were analyzed in patients with gastric cancer.ResultsThe overexpression rate of miR-451 was 38.04%in gastric cancer，which was significantly lower than 76.60%in adjacent normal tissues（χ2=18.503，P＜0.001）.The overexpression rate of miR-451 was significantly lower inⅢ-Ⅳstages of gastric cancer than that inⅠ-Ⅱstages（27.3%vs 54.1%，P=0.009）.The expression of miR-451 was also lower in patients with lymph node metastasis than that in patients without lymph node metastasis （27.1%vs 57.6%，P=0.004）.However，there were no significant differences in miR-451 expressions between different age，gender，histological grade and T stage groups（P＞0.05）.The overall survival rate was significantly higher in patients with high expression of miR-451 than that in patients with low expression of miR-451（69.2%vs 39.1%，P=0.003）.Conclusion miR-451 is associated with the malignant transformation，progression，and prognosis of gastric cancer，and which can be used as a potential target of therapy and a biomarker of diagnosis and prognosis of gastric cancer in the future.

stomach neoplasms；carcinoma；prognosis；gene expression；in situ hybridization；miR-451

R735.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.012

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31100935）

湖南衡陽，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)中心（郵編421001）

陳濤（1979），男，主治醫(yī)師，學(xué)士，主要從事消化、急診醫(yī)學(xué)研究