崔曼，張欣，馬麗桃，熊艷杰，車(chē)鵬程，姚芳蓮，孫紅△

新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其組織相容性評(píng)價(jià)

崔曼1，張欣1，馬麗桃1，熊艷杰1，車(chē)鵬程1，姚芳蓮2，孫紅1△

目的構(gòu)建并評(píng)價(jià)新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)的組織相容性。方法采用仿生學(xué)方法，將殼聚糖、羥基磷灰石、明膠、果膠按一定比例制成新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)，將小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1與材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)倒置相差顯微鏡、石蠟切片常規(guī)染色、掃描電鏡、F-DA熒光染色法評(píng)價(jià)細(xì)胞相容性；將制備好的生物支架材料植入SD大鼠的背部皮下，術(shù)后2、4、8、12周評(píng)價(jià)組織相容性、血管化能力及體內(nèi)降解情況。結(jié)果新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)呈三維多孔狀，細(xì)胞在材料上貼附生長(zhǎng)良好，呈多角形或梭形，形態(tài)飽滿；皮下包埋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：早期有輕微的炎癥反應(yīng)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而消退，后期有血管化發(fā)生，材料降解吸收比較緩慢。結(jié)論新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)組織相容性好，易于血管化，是一種很好的骨組織工程支架材料。

新生血管化，生理性；組織相容性；組織工程；殼聚糖；三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)

由創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥等造成的大范圍骨缺損如果沒(méi)有骨移植材料很難被修復(fù)，因此尋找理想的骨移植材料仍是外科的難題之一。目前，已經(jīng)有很多種天然材料和合成材料用于修復(fù)骨缺損以促進(jìn)骨再生［1］。三維支架可以創(chuàng)造一種微環(huán)境，支撐細(xì)胞黏附生長(zhǎng)、增殖和發(fā)揮功能。此外，骨組織工程支架材料還應(yīng)具有一定的力學(xué)強(qiáng)度和接近正常人骨的孔隙率和孔徑［2］。為此，本研究以殼聚糖、明膠、果膠為基材，通過(guò)接枝偶聯(lián)反應(yīng)，引入活性基團(tuán)，經(jīng)納米羥基磷灰石的原位生成反應(yīng)，構(gòu)建了新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)，并利用細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)法和皮下植入試驗(yàn)評(píng)價(jià)該材料的組織相容性，為臨床骨缺損修復(fù)選擇合適的骨移植材料提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，MC3T3-E1細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供），胎牛血清（天津血液研究所），α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），二甲基亞砜（DMSO，天津?yàn)笊锕こ坦荆?，掃描電鏡（XL30 PHILIPS，荷蘭），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（Olympus，日本）。常規(guī)培養(yǎng)基組分：α-MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)的制備由天津大學(xué)化工學(xué)院高分子科學(xué)與工程系提供，采用仿生學(xué)方法，在殼聚糖加明膠的基礎(chǔ)上，將羥基磷灰石和果膠的復(fù)合物分散到殼聚糖明膠溶液中，以戊二醛交聯(lián)形成新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)。材料按實(shí)驗(yàn)的要求制備成直徑1 cm，厚0.5 cm，60Co照射消毒備用。

1.2.2新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)與MC3T3-E1細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)將MC3T3-E1細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)并加入5 mL常規(guī)培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔48 h換新鮮培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞相互融合達(dá)80%～90%時(shí)用0.25%胰酶消化，新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，將MC3T3-E1細(xì)胞懸液以2×105/mL密度接種，每孔加1 mL常規(guī)培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.3觀察指標(biāo)24 h、72 h時(shí)倒置相差顯微鏡觀察新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)邊緣的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基有無(wú)混濁。于接種后1 d、7 d、14 d取材，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠固封，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。于接種后1 d、7 d、14 d取材，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)特征。利用熒光素二醋酸鹽（F-DA）原位檢測(cè)材料內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。

1.2.4皮下植入實(shí)驗(yàn)取SD大鼠12只，材料植入前60Co照射消毒。術(shù)前3 d用8%硫化鈉對(duì)手術(shù)部位脫毛，手術(shù)當(dāng)天用10%的水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉。固定后用75%乙醇消毒手術(shù)部位3次，然后鋪無(wú)菌孔巾，在脊柱正中切開(kāi)皮膚，切口長(zhǎng)約3 cm，提起腰背筋膜剪開(kāi)，鈍性分離，將材料左右各埋入1枚，縫合皮膚。術(shù)后3 d每天給予青霉素5萬(wàn)U，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后2、4、8、12周分別處死3只大鼠，取出實(shí)驗(yàn)材料，剖開(kāi)組織和材料界面，觀察組織包繞情況及炎癥反應(yīng)程度。4%多聚甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，光鏡觀察。

2　結(jié)果

2.1新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)的大體形態(tài)及掃描電鏡下結(jié)果大體外觀呈多孔海綿狀。掃描電鏡下可見(jiàn)三維多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，材料平均孔隙率為90%，空隙之間的連通較好，空隙形態(tài)、取向規(guī)則有序，測(cè)量孔徑大小為100～200 μm，見(jiàn)圖1。

Fig.1　SEM observation on the novel 3-D composite bionic network（×100）圖1　新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)掃描（×100）

2.2倒置相差顯微鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后細(xì)胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)，2～3 h細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24 h細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，大部分細(xì)胞伸出突起，與鄰近細(xì)胞的突起相連，48 h細(xì)胞逐漸接觸相連成片狀，3～5 d細(xì)胞長(zhǎng)成致密的單層，界限不清。MC3T3-E1細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)，可觀察到周邊細(xì)胞貼附生長(zhǎng)好，培養(yǎng)基無(wú)混濁。

2.3HE染色觀察細(xì)胞分別于接種后1、7、14 d，HE染色顯示細(xì)胞形態(tài)清晰，呈梭形、紡錘狀或多角形，細(xì)胞核大，呈圓形或橢圓形，核仁清楚可見(jiàn)。細(xì)胞接種后14 d，細(xì)胞數(shù)量增多，貼附生長(zhǎng)良好，呈多角形或梭形，細(xì)胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)粉染的細(xì)胞外基質(zhì)，見(jiàn)圖2。

Fig.2　Histology observation on the 14-day-co-culturing tissue（HE，×200）圖2　復(fù)合培養(yǎng)14 d組織學(xué)觀察（HE×200）

2.4掃描電鏡觀察接種細(xì)胞后第1天，可見(jiàn)少量MC3T3-E1細(xì)胞呈球形，較為分散；其后細(xì)胞增多，呈梭形、星形；細(xì)胞進(jìn)一步增殖，形態(tài)飽滿并相互融合，伸出偽足狀細(xì)長(zhǎng)突起，伸入材料間，形成一種錨狀結(jié)構(gòu)，牢固黏附于材料表面，并具有良好的伸展?fàn)顟B(tài)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度逐漸增加，至14 d通過(guò)材料網(wǎng)狀孔隙觀察，在材料附著的細(xì)胞分裂增殖，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)包裹材料，見(jiàn)圖3。

Fig.3　SEM observation on the 14-day-co-culturing tissue（×500）圖3　復(fù)合培養(yǎng)14 d掃描電鏡觀察（×500）

2.5熒光染色細(xì)胞分別于接種后1、7、14 d進(jìn)行熒光染色觀察。F-DA熒光染色顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)清晰，呈長(zhǎng)梭形或多角形，部分區(qū)域的細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，有形成結(jié)節(jié)的趨勢(shì)；接種后第14天細(xì)胞還可在孔內(nèi)呈多層生長(zhǎng)，見(jiàn)圖4。

Fig.4　Fluorescence staining observation on the 14-day-co-culturing tissue（×100）圖4　復(fù)合培養(yǎng)14 d F-DA染色熒光電鏡觀察（×100）

2.6組織相容性觀察大體標(biāo)本觀察：手術(shù)后5 d，所有大鼠切口愈合良好，無(wú)感染現(xiàn)象。分別在術(shù)后2、4、8、12周以過(guò)量麻醉藥分次注射，使動(dòng)物深度麻醉，在背部原切口部位切開(kāi)皮膚，發(fā)現(xiàn)多數(shù)材料無(wú)移位，在材料周?chē)? cm處整塊切下組織，在包埋部位未發(fā)現(xiàn)感染、積液及材料碎裂，且材料降解緩慢，至12周仍可見(jiàn)材料。術(shù)后2周，材料完整，表面可見(jiàn)細(xì)小出血點(diǎn)，易于剝離；術(shù)后4周，材料表面可見(jiàn)明顯毛細(xì)血管；術(shù)后8周，材料與組織粘連緊密，不易剝離，毛細(xì)血管較前更多；術(shù)后12周，材料與周?chē)M織界限不清。

HE染色觀察：2周時(shí)無(wú)組織壞死現(xiàn)象，可見(jiàn)少量散在的中性粒細(xì)胞（無(wú)明顯聚集）、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，未見(jiàn)明顯的吞噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞，見(jiàn)圖5A；4周時(shí)炎性細(xì)胞減少，新生的血管和成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入，見(jiàn)圖5B；8周時(shí)微孔狀間隙部分充滿成纖維細(xì)胞、大量的功能性毛細(xì)血管，并可見(jiàn)多核巨細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，見(jiàn)圖5C；12周時(shí)材料的微孔狀結(jié)構(gòu)未消失，但間隙出現(xiàn)纖細(xì)的膠原纖維，排列較規(guī)律，血管較前減少，見(jiàn)圖5D。

3　討論

3.1骨組織工程的基本要素支架、種子細(xì)胞與生長(zhǎng)因子是骨組織工程學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，尋找理想的細(xì)胞外支架材料更是現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。理想的支架材料必須具備良好的生物相容性和可降解性、一定的機(jī)械強(qiáng)度、三維多孔結(jié)構(gòu)和骨傳導(dǎo)性［3-4］。

3.2殼聚糖、明膠、果膠等應(yīng)用于骨組織工程材料的構(gòu)建殼聚糖是多糖中僅有的一種堿性氨基多糖，其結(jié)構(gòu)和某些性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分氨基多糖極相似，利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖，具有明顯堿性、良好的生物相容性和生物降解性［5］，可將其改造成需要的形狀和強(qiáng)度，如凝膠液、凝膠膜、多孔三維支架材料應(yīng)用于組織工程中［6］。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要結(jié)構(gòu)蛋白，明膠是其部分變性衍生物，具有良好的生物相容性。其中含有天冬氨酸-甘氨酸細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，利于細(xì)胞粘連。殼聚糖-明膠復(fù)合物可以模擬ECM作為皮膚和軟骨的替代材料。果膠富含半乳糖醛酸及甲酯化的半乳糖醛酸單位，可結(jié)合蛋白質(zhì)和其他多糖，存在于植物細(xì)胞壁中，有剛性且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定［7］。果膠是一種聚陰離子多糖，可以攜帶信號(hào)分子并傳輸許多生物活性物質(zhì)，可以作為一種新的生物醫(yī)用材料［8］。

3.3納米羥基磷灰石在骨組織工程中的作用天然骨是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生物復(fù)合材料，1/3為有機(jī)成分，其中膠原占90%，非膠原成分占10%，2/3為無(wú)機(jī)成分，主要是磷酸鈣鹽類，基本單位為納米級(jí)羥基磷灰石［9］。因此提高材料的機(jī)械性能十分重要，為了更好地模擬天然組織中細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在殼聚糖-明膠-果膠網(wǎng)絡(luò)復(fù)合膜的基礎(chǔ)上加入納米羥基磷灰石制成新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)。納米羥基磷灰石是一種性能優(yōu)良的無(wú)機(jī)陶瓷材料，同時(shí)具有獨(dú)殊的特性，例如良好的生物相容性和生物活性，以及柔韌的組織結(jié)構(gòu)，是一種可應(yīng)用于臨床的很有潛能的組織工程材料［10］。復(fù)合支架中納米羥基磷灰石的加入能提高支架的生物相容性［11］，在增強(qiáng)細(xì)胞增殖的同時(shí)，還促進(jìn)了材料的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性［12］。

3.4組織相容性評(píng)價(jià)在評(píng)價(jià)材料的相容性過(guò)程中，最直接的方法是體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)法和體內(nèi)直接接觸法。細(xì)胞培養(yǎng)法是檢測(cè)材料生物相容性的重要手段之一，具有敏感性高和實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)［13］。本實(shí)驗(yàn)采用MC3T3-E1細(xì)胞，細(xì)胞行為與成骨細(xì)胞相似；材料具有大小合適的孔徑、較高的孔隙率和類似自然骨的連通微孔結(jié)構(gòu)，利于MC3T3-E1細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲入和廢物的排出，并促進(jìn)細(xì)胞在材料上的遷移、分化和增殖。通過(guò)將MC3T3-E1細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)，直接觀察細(xì)胞的貼附生長(zhǎng)、分化和增殖情況，細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)良好，分布均勻，結(jié)合牢固，無(wú)排斥反應(yīng)發(fā)生，說(shuō)明新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)的所有組分具有適合細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，該材料適合種子細(xì)胞的停泊、生長(zhǎng)、黏附、增殖，可用做組織工程支架。“體內(nèi)植入試驗(yàn)”將材料植入大鼠背部皮下，可從宏觀和微觀水平評(píng)價(jià)材料對(duì)組織的局部反應(yīng)，包括早期的炎癥反應(yīng)和后期血管化及纖維增生情況。然而，在骨組織再生的一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是血管化，如果血液供應(yīng)（營(yíng)養(yǎng)和氧氣）不能快速建立，該中心的工程化骨將很快出現(xiàn)壞死。由于氧在活組織的毛細(xì)血管擴(kuò)散是有限的，約150 μm［平均毛細(xì)血管間距為（304±30）μm］，因此，在較大體積的組織工程構(gòu)建中，血管化情況至關(guān)重要［14］。本研究顯示該材料引起體內(nèi)的炎癥反應(yīng)輕微且持續(xù)時(shí)間很短，4周左右即明顯緩解，在4～8周可見(jiàn)大量新生血管的形成，在12周左右穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的組織相容性。組織學(xué)觀察可以獲得早期、充分的血管化，降解吸收緩慢。因此新型三維復(fù)合仿生網(wǎng)絡(luò)在短期觀察中具有良好的組織相容性，但該材料植入骨缺損部分是否具有成骨誘導(dǎo)活性和增加骨愈合，是否可以用于骨重建和骨缺損的替代材料，需要進(jìn)一步研究。

（圖5見(jiàn)插頁(yè)）

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（2014-09-09收稿2014-10-20修回）

（本文編輯李鵬）

Construction of novel 3-D composite bionic network and evaluation of its histocompatibility

CUI Man1，ZHANG Xin1，MA Litao1，XiongYanjie1，CHE Pengcheng1，YAO Fanglian2，SUN Hong1△
1 Department of Pathology，Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2 School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University
△Corresponding authorE-mail：xsun1@hotmail.com

ObjectiveTo construct novel 3-D composite bionic network and evaluate the histocompatibility.MethodsThe novel 3-D composite bionic network was prepared from chitosan，hydroxyapatite，gelatin and pectin in certain ratio by biomimtic approach，which was co-cultured with MC3T3-E1.The cell compatibility was studied by using inverted phase contrast microscope，routine paraffin section staining，scanning electron microscopy and F-DA staining.The resultant scaffold material was implanted into the dorsal subcutaneous space of SD rats.The histocompatibility，blood vessel capabilities and the degradation of the material were observed 2，4，8 and 12 weeks after surgery.ResultsThe structure of novel 3-D composite bionic network was three-dimensional and porous.The cells attached on scaffolds attached and grew well with polygonal or fusiform form.It was found that inflammatory reactions were alleviated gradually in the early stage.There was an increasing angiogenesis at late stage.Materials degraded and absorbed more slowly.ConclusionThe present study suggests that the novel 3-D composite bionic network has good histocompatibility with easy vascularization，and will be a candidate scaffold for bone tissue engineering.

neovascularization，physiologic；histocompatibility；tissue engineering；chitosan；3-D composite bionic network

R318.08

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81101448）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2011401006，H2012401017）；河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目（C201400560）

1河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室（郵編063000）；2天津大學(xué)化工學(xué)院

崔曼（1987），女，碩士在讀，主要從事組織工程方面研究

△E-mail：xsun1@hotmail.com