郝娥娥，關(guān)鍵，許西琳，高巖，張中宏，王莎莎，王珊

ADAM 33基因S1、S2位點單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性的關(guān)系

郝娥娥，關(guān)鍵△，許西琳，高巖，張中宏，王莎莎，王珊

目的探討ADAM 33基因S1、S2位點單核苷酸多態(tài)性（SNP）與中國新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者易感性的關(guān)系。方法收集217例COPD患者（病例組）和218例健康對照者（對照組）外周血標(biāo)本，提取標(biāo)本DNA，采用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司（ABI）SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測ADAM 33基因S1、S2位點單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果病例組和對照組S1位點CC、CT、TT 3種基因型分布和C、T等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；S2位點CC、CG、GG 3種基因型分布和C、G等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組S1、S2位點基因型與肺功能相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系顯示：S1、S2位點3種基因型第1秒用力呼氣容積（FEV1）預(yù)計值（%）比較、FEV1/用力肺活量（FVC）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。單體型分析結(jié)果顯示3種單體型在病例組和對照組中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論ADAM 33基因S1、S2位點SNPs與新疆維吾爾族人群COPD患者易感性無明顯相關(guān)性。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白質(zhì)類；多態(tài)性，單核苷酸；維吾爾族；ADAM 33基因

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)；目前COPD的發(fā)病機制仍未完全闡明，環(huán)境方面吸煙是COPD發(fā)生、發(fā)展最重要的危險因素。然而，并不是所有COPD患者都是由吸煙引起的，這表明遺傳因素在COPD的發(fā)病機制中也起一定作用。研究發(fā)現(xiàn)解整合素-金屬蛋白酶33 （ADAM33）基因是哮喘和氣道高反應(yīng)性（AHR）的易感基因［1］。隨后研究發(fā)現(xiàn)該基因與肺功能下降也具有相關(guān)性；而氣道高反應(yīng)性與肺功能下降是COPD病程發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素［2］。近期已有研究發(fā)現(xiàn)ADAM 33基因與COPD存在一定的相關(guān)性［3］。ADAM 33基因與COPD的相關(guān)性研究已成為當(dāng)前熱點。本研究旨在探討ADAM 33基因S1、S2位點單核苷酸多態(tài)性（SNP）與新疆維吾爾族人群COPD易感性及肺功能下降的關(guān)系，從分子水平研究遺傳因素在新疆維吾爾族人群COPD發(fā)病中的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象病例組選自2013年1月—2014年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院、伊犁州新華醫(yī)院、沙灣縣人民醫(yī)院呼吸科住院及門診COPD患者，所有COPD診斷符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》。COPD肺功能診斷標(biāo)準(zhǔn)：第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%。經(jīng)過詳細(xì)詢問病史及體格檢查，并進行胸部X線檢查和肺功能測定，共納入217例COPD患者；同期選取218例健康體檢者作為對照組。2組間性別、年齡、吸煙史、吸煙指數(shù)、體質(zhì)指數(shù)（BMI）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)EV1預(yù)計值（%）、FEV1/ FVC（%）比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。排除支氣管哮喘、支氣管擴張、間質(zhì)性肺疾病、心血管疾病、肺癌等病史。所有收集資料人員進行嚴(yán)格培訓(xùn)，入選對象均簽署知情同意書。

Tab.1　Basic information of two groups表1　病例組和對照組的基本資料

1.2方法

1.2.1DNA提取所有入選對象采外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用TIANGEN生化科技有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒（非離心柱型）提取DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2ADAM3基因S1、S2位點多態(tài)性檢測 （1）引物設(shè)計。根據(jù)GenBank提供的基因序列，使用Primer 3軟件設(shè)計引物，S1、S2位點在基因上位置臨近共用1對引物序列，F(xiàn)：5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′；R：5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′，擴增片段長度為365 bp。采用SNaPshot分型方法進行分型：對分型結(jié)果進行雙盲樣本質(zhì)控和陰性對照質(zhì)控；SNaPshot反應(yīng)過程中SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物序列：S1位點TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTGCTGGCCATGCTCCTCAGC；S2位點 TTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTGCTGCCTCTGCTCCCAGG。（2）PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（10 μL）包含10×HotStarTaq buffer 1 μL，25 mmol/L Mg2+0.6 μL，2.5 mmol/L dNTP1.2 μL，5 U/μL Hot-StarTaq polymerase（Qiagen Inc）0.2 μL，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物（上下游引物各0.5 μL），5 μL超純水。多重PCR反應(yīng)采用Touch-down PCR反應(yīng)程序：95℃變性2 min；94℃變性20 s，65℃退火40 s，每個循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，11個循環(huán)。然后94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，24個循環(huán)。最后72℃延伸2 min。結(jié)束后4℃保存。PCR擴增后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的片段則表明實驗成功。（3）PCR產(chǎn)物純化。在15 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP和2 U ExoⅠ酶，震蕩混勻，37℃保溫1 h，然后75℃保溫15 min以滅活SAP和ExoⅠ酶。純化好的模板可以在4℃保存24 h或-20℃長期保存。（4）延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系（10 μL）包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit （ABI），2 μL純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μL延伸引物混合物，2 μL超純水。延伸反應(yīng)程序：96℃變性1 min；然后96℃變性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸30 s，28個循環(huán)；最后60℃延伸30 s。結(jié)束后4℃保存。延伸產(chǎn)物純化：在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1U SAP，震蕩混勻，37℃保溫1 h，75℃保溫15 min以滅活酶，4℃可保存24 h或-20℃長期保存。（5）延伸產(chǎn)物測序。取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di Formamide混勻，總體積10 μL，95℃變性5 min后上 ABI3730XL測序儀。運用 GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）軟件對實驗結(jié)果進行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗?；蝾l率采用基因計數(shù)法計算，使用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。運用Haploview軟件分析S1、S2位點之間的連鎖不平衡關(guān)系；使用Phase軟件推斷群體樣本的單體型。組間基因型及等位基因頻率、單體型分布差異比較采用χ2檢驗，并計算OR值和95%CI。P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ADAM33基因S1、S2位點PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果因ADAM33基因S1、S2位點位置臨近，PCR擴增產(chǎn)物為一段長365 bpDNA片段，見圖1。

2.2ADAM33基因S1、S2位點測序結(jié)果S1位點對照組217個樣本基因分型成功，1個樣本基因分型失敗；病例組216個樣本基因分型成功，1個樣本基因分型失敗。S2位點對照組217個樣本基因分型成功，1個樣本基因分型失敗；病例組215個樣本基因分型成功，2個樣本基因分型失敗。測序結(jié)果經(jīng)GeneMapper4.1軟件處理后S1、S2位點的SNaP-shot圖像，見圖2、3。

Fig.1 The electrophoresis map of PCR product of part samples of S1，S2 locus in ADAM33 gene圖1 ADAM33基因S1、S2位點部分樣品PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.2　S1 locus waveform and genotype of ADAM33 gene圖2ADAM33基因S1位點的波形和基因型

Fig.3　S2 locus waveform and genotype of ADAM33 gene圖3ADAM33基因S2位點的波形和基因型

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗S1位點病例組、對照組χ2分別為0.005、2.116，S2位點病例組、對照組χ2分別為0.118、0.013（均P＞0.05），2組研究樣本的群體代表性良好。

2.42組基因型及等位基因頻率分布比較病例組與對照組中S1、S2位點的基因型以及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、3。

2.5病例組ADAM33基因S1、S2位點基因型與肺功能相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系S1、S2位點不同基因型間FEV1預(yù)計值（%）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，S1、S2位點不同基因型間FEV1/FVC比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

2.6ADAM33基因S1、S2位點之間連鎖不平衡及單體型分析S1、S2位點存在連鎖不平衡（D′值= 1）。單體型在病例組和對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

Tab.2　Comparison of S1 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表2　病例組與對照組S1位點基因型及等位基因頻率分布比較　例（%）

Tab.3　Comparison of S2 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表3　病例組與對照組S2位點基因型及等位基因頻率分布比較　例（%）

Tab.4 The relationship between S1,S2 locus genotype of ADAM 33 gene and clinical indicators of lung function in patient group表4病例組ADAM33基因S1、S2位點基因型與肺功能指標(biāo)的關(guān)系?。?,±s）

均P＞0.05

S1位點基因型C/C C/T+T/T t n 188 28 FEV1預(yù)計值57.40±12.55 58.75±12.11 0.532 FEV1/FVC 56.02±9.43 56.79±9.73 0.401 S2位點基因型C/C C/G G/G F n 123 78 14 FEV1預(yù)計值58.25±12.48 56.50±12.41 58.43±13.31 0.499 FEV1/FVC 56.83±8.74 55.24±9.51 54.71±14.59 0.831

3　討論

ADAM 33是ADAM基因超家族的一員，編碼ADAM 33的基因定位于20號染色體短臂（20p13），含22個外顯子和21個內(nèi)含子，長度超過14 kb，編碼一種基質(zhì)金屬蛋白酶，包含813個氨基酸，其結(jié)構(gòu)類似于ADAM家族的其他成員，由8個結(jié)構(gòu)域組成［4］。2002年，Van Eerdewegh發(fā)現(xiàn)ADAM 33與哮喘相關(guān)，可作為其候選基因。近期研究發(fā)現(xiàn)，ADAM 33可以影響多種疾病表型；在慢性氣道疾病中，對于ADAM 33基因的認(rèn)識不再僅局限于支氣管哮喘。人們又把ADAM 33基因作為COPD的易感基因在不同人群中進行研究［5］。目前研究表明，ADAM 33基因多態(tài)性是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素［3］，但ADAM 33基因多態(tài)性是如何參與COPD的發(fā)病機制與病情進展，以及如何影響其發(fā)病尚未完全明了。

Tab.5　Comparison of S1,S2 locus haplotype frequency between two groups表5　病例組和對照組S1、S2位點單體型頻率比較例（%）

最近關(guān)于ADAM33基因多態(tài)性與COPD的關(guān)聯(lián)性研究較多，其中ADAM33基因S1、S2位點多態(tài)性在不同人群中的研究結(jié)果也不盡相同。2007年Gosman等［6］對參與GLUCOLD計劃的COPD患者進行研究，分析了ADAM 33基因的8個多態(tài)性基因位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1、T2、S2、ST+5等4個位點與COPD的易感性相關(guān)，而Q-1、S1、F+1、V4與COPD無相關(guān)性。Tan等［7］對中國蒙古族人群ADAM 33基因的8個多態(tài)性基因位點行基因型分型，發(fā)現(xiàn)S1、S2、Q-1和F+1位點與COPD有一定相關(guān)性。Sadeghnejad等［8］對高加索人群中的研究發(fā)現(xiàn)Q-1、S1、S2、V1、V4位點與COPD易感性相關(guān)。Zhou等［9］對亞洲人群ADAM 33基因的9個多態(tài)性基因位點進行Meta分析，結(jié)果顯示T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位點與COPD的發(fā)生有關(guān)聯(lián)；而V4、T+1、S2位點與COPD無關(guān)聯(lián)。Li等［10］對中國人群ADAM 33基因中的T1、S2位點進行Meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2位點與COPD無關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果的不同表明目前對于S1、S2位點與COPD的發(fā)生有無相關(guān)性仍無定論。

本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)ADAM33基因S1、S2位點多態(tài)性及單體型與COPD具有相關(guān)性。這可能與種族、地域的差異有關(guān)，不同人群與COPD相關(guān)的ADAM 33基因SNP位點可能不盡相同。且此次試驗只對ADAM33基因上的2個位點進行了研究，對于其他位點與新疆維吾爾人群COPD患者的關(guān)系尚不清楚。也有可能因為COPD發(fā)病的調(diào)節(jié)因素眾多，單個基因的研究不能反映COPD發(fā)病機制的復(fù)雜性，發(fā)病機制復(fù)雜的不同都可使基因頻率分布不同，所以有必要進一步檢測ADAM33基因中其他區(qū)域的多態(tài)性位點與COPD的關(guān)系，建立一個完整的與疾病風(fēng)險相關(guān)的基因體系。另外本次試驗檢測的樣本量并不能完全代表整個人群的基因突變情況，應(yīng)該進一步擴大樣本量降低造成ADAM33基因多態(tài)性位點假陰性結(jié)果的可能。

［1］Yilihamu N，Wushouer Q，Arkin K，et al.Association of a disintegrin and metalloprotease 33 gene polymorphisms with asthma［J］.Mol Clin Oncol，2014，2（6）:1076-1080.

［2］Poon AH，Houseman EA，Ryan L，et al.Variants of asthma and chronic obstructive pulmonary disease genes and lung function decline in aging［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2014，69（7）:907-913.doi:10.1093/gerona/glt179.

［3］Korytina GF，Tselousova OS，Akhmadishina LZ，et al.Association of the MMP3，MMP9，ADAM33 and TIMP3 genes polymorphic markers with development and progression of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Mol Biol（Mosk），2012，46（3）:487-499.

［4］Tripathi P，Awasthi S，Gao P.ADAM metallopeptidase domain 33 （ADAM33）:a promising target for asthma［J］.Mediators Inflamm. 2014，2014:572025.doi:10.1155/2014/572025.

［5］Wang X，Li L，Xiao J，et al.Association ofADAM33 gene polymorphisms with COPD in a northeastern Chinese population［J］.BMC Med Genet，2009，10（10）：132-138.doi:10.1186/1471-2350-10-132.

［6］Gosman MM，Boezen HM，van Diemen CC，et al.A disintegrin and metalloprotease 33 and chronic obstructive pulmonary disease pathophysiology［J］.Thorax，2007，62（3）:242-247.

［7］Tan J，Liu AP，Sun C，et al.Association of ADAM 33 gene polymorphisms with COPD in the Mongolian population of China［J］.Ann Hum Biol，2014，41（1）:9-14.doi:10.3109/03014460.2013.821165.

［8］Sadeghnejad A，Ohar JA，Zheng SL，et al.Adam33 polymorphisms are associated with COPD and lung function in long-term tobacco smokers［J］.Respir Res，2009，10:21.doi:10.1186/1465-9921-10-21.

［9］Zhou DC，Zhou CF，Toloo S，et al.Association of a disintegrin and metalloprotease 33（ADAM33）gene polymorphisms with the risk of COPD:an updated meta-analysis of 2，644 cases and 4，804 controls ［J］.Mol Biol Rep，2015，40（2）:409-422.doi:10.1007/s11033-014-3782-5.

［10］Li DD，Guo SJ，Jia LQ，et al.Association of a disintegrin and metalloproteinase 33（ADAM33）gene polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease in the Chinese population:a meta-analysis［J］.Genet Mol Res，2014，13（3）:6391-6397.doi:10.4238/2014. August.25.2.

（2014-09-24收稿2014-11-01修回）

（本文編輯李國琪）

Association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM33 gene and chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang Uygur population

HAO Ee，GUAN Jian△，XU Xilin，GAO Yan，ZHANG Zhonghong，WANG Shasha，WANG Shan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China
△Corresponding AuthorE-mail:guanjian6@163.com

ObjectiveTo investigate the association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and lung function in Xinjiang Uygur population.MethodsBlood samples from 217 COPD patients and 218 healthy controls were collected.Samples of DNA was extracted，and S1，S2 single nucleotide polymorphism（ADAM 33）was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping.ResultsThere were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CT，TT genotypes and C，T alleles between patient group and control group（P＞0.05）.There were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CG，GG genotypes and C，G alleles between patient group and control group（P＞0.05）.In patient group，there were no significant differences in S1，S2 locus genotype and clinical indicators of lung function display，and in the FEV1%predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.Haplotype analysis showed that there were no significant differences in three kinds of haplotypes between patient group and control group（P＞0.05）.ConclusionThere is no significant difference in the polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur population.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；UYGUR nationality；ADAM 33

R563

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.002

國家自然科學(xué)基金資助項目（81360009）

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（郵編832008）

郝娥娥（1988-），女，碩士研究生，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究

△E-mail:guanjian6@163.com