韓曉弟， 劉　丹

(1.山東大學(xué)海洋學(xué)院,山東 威?！?64209；2.山東省林木種質(zhì)資源中心，濟(jì)南　250014)

· 試驗(yàn)研究 ·

鉛離子對(duì)輪葉黑藻生長的毒性影響

韓曉弟1， 劉丹2

(1.山東大學(xué)海洋學(xué)院,山東 威海264209；2.山東省林木種質(zhì)資源中心，濟(jì)南250014)

以常見多年生沉水植物輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)為材料，探討水體重金屬Pb2+對(duì)其生長的影響及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化。比較研究了不同濃度(0.01，0.05，0.10，0.20mg/L)的Pb2+對(duì)輪葉黑藻的脅迫影響，包括葉綠素、葉綠素a/b比值、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：在Pb2+脅迫下，黑藻葉片呈現(xiàn)不同程度的枯黃萎蔫現(xiàn)象，其程度隨著處理濃度的增高而加重；葉綠素a和葉綠素b含量及葉綠素a/b值降低；脯氨酸、可溶性糖及丙二醛含量升高，試驗(yàn)表明Pb2+對(duì)輪葉黑藻生長的毒性影響明顯。

輪葉黑藻；鉛離子；脯氨酸；葉綠素；丙二醛；可溶性糖；毒理學(xué)

隨著工業(yè)污水和人類生活廢水的排放，重金屬污染越來越突出，有關(guān)重金屬對(duì)生物的毒害作用及機(jī)理的研究也日趨增加。鉛是污染物中毒性很大的一種重金屬元素，低濃度的Pb2+對(duì)植物的代謝過程或酶的活性具有一定促進(jìn)作用，但是在高濃度和長時(shí)間脅迫時(shí)，對(duì)植物會(huì)產(chǎn)生明顯的傷害作用[1]。同時(shí)，鉛對(duì)人類健康危害較大，進(jìn)入人體后主要積蓄在骨骼、動(dòng)脈、肝、腎、胰和肺中，也可進(jìn)入腦部[2],鉛能置換骨骼中的鈣而儲(chǔ)存在骨中，可對(duì)人的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腎臟、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等多個(gè)器官和系統(tǒng)造成損傷，而且具有一定致突變和致癌性[3,4]。研究表明，鉛會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧自由基水平急劇上升，當(dāng)這種自由基超出植物體活性氧清除酶清除能力時(shí)，氧自由基將會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生危害，影響植物的生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)致植物死亡[5]。

作為水生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者之一，高等水生植物具有重要的環(huán)境凈化功能，不僅可去除N、P等營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)污染負(fù)荷，還可吸附、吸收污水中的重金屬和有害元素[6]。多數(shù)水生植物能吸附并積累重金屬，對(duì)水環(huán)境起到凈化作用。一般情況下水生植物凈化能力的大小是：沉水植物>漂浮植物和浮葉植物>挺水植物[7]，因此，一些水生植物常用于構(gòu)建人工濕地或植物塘[8～10]，以達(dá)到減輕地表水體污染的目的。

輪葉黑藻隸屬于水鱉科(Hydrocharitaceae)、黑藻屬(Hydrilla)，多年生沉水植物[11]。具有耐污能力和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在國內(nèi)外富營養(yǎng)化水體治理和生態(tài)修復(fù)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)，輪葉黑藻對(duì)重金屬具有很強(qiáng)的吸收積累能力[12]。鑒于輪葉黑藻在生物多樣性及生態(tài)環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域的的重要性，利用植物生理生化手段測定葉綠素、葉綠素a/b比值、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛等毒理學(xué)指標(biāo)的變化，研究Pb2+對(duì)輪葉黑藻生長發(fā)育的影響，為探討重金屬對(duì)植物的脅迫機(jī)理及植物對(duì)其逆境的反應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

輪葉黑藻采集于威海市環(huán)山路陶家夼隧道周圍某小型池塘，由第一作者鑒定，標(biāo)本保存在山東大學(xué)(威海)植物標(biāo)本室。實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)(澳大利亞產(chǎn)，VARIAN-50型 )，離心機(jī)(TDL-5-A,上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3鉛離子濃度設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和4個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)組。用Pb(NO3)2配制質(zhì)量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.20mg/L的Pb2+培養(yǎng)液，以純凈水作為對(duì)照。各濃度實(shí)驗(yàn)組均設(shè)五次重復(fù)，生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果為5次重復(fù)的平均值。

鉛離子濃度設(shè)置依據(jù)：中華人民共和國國家環(huán)?？偩职l(fā)布的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 3838-2002)：Ⅰ類水鉛含量≤0.01mg/L,Ⅴ類水鉛含量≤0.1mg/L(pH要求在6～9之間)。

1.4材料處理

選擇生長狀況相似的黑藻分別放入裝有不同Pb2+濃度的容器中，室溫下培養(yǎng)，共培養(yǎng)5d，每隔24h觀察輪葉黑藻的外部形態(tài)變化，并分別測量輪葉黑藻的生理生化指標(biāo)。每天測量一次各培養(yǎng)液的pH值，以保證實(shí)驗(yàn)的有效性。

1.5生理指標(biāo)測試

1.5.1植株葉片傷害癥狀觀察

每隔24h觀察輪葉黑藻的生長狀況，葉片顏色及萎蔫變化等外部形態(tài)指標(biāo)。

1.5.2葉綠素濃度測定

葉綠素含量測定采用分光光度法[13](稍有改動(dòng))。

1.5.3脯氨酸含量測定

脯氨酸含量測量選用酸性茚三酮法[14,15]。

脯氨酸含量計(jì)算公式： y(mg/g) =(876.399*D520-7.151)*10mL/1000/樣品質(zhì)量(g)。

1.5.4丙二醛含量測定

以硫代巴比妥酸法測量丙二醛含量[14,15]。

丙二醛含量計(jì)算公式：y(mg/g)={6.45(D532-D600)-0.56*D450}*5mL/1000/樣品質(zhì)量(g)。

1.5.5可溶性糖含量測定

用蒽酮法[13](稍有改動(dòng))可溶性糖含量。

可溶性糖含量：y(mg/g)=(138.666*D630-4.119)*10mL/1000/樣品質(zhì)量(g)。

1.5.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)求平均值，將數(shù)據(jù)利用SPSS軟件，按照方差分析法進(jìn)行處理分析，檢測不同處理的樣品間及與對(duì)照間的差異顯著性。數(shù)據(jù)顯示均為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1外部形態(tài)傷害癥狀

實(shí)驗(yàn)前各組輪葉黑藻生長狀況良好。1d后，在最高濃度處理組中的輪葉黑藻葉片有輕微的褪色現(xiàn)象出現(xiàn)，與對(duì)照組植株葉片相比顏色偏黃。隨著處理時(shí)間的延長，植物體的褪色現(xiàn)象逐漸增大，各實(shí)驗(yàn)組植株葉片均出現(xiàn)了程度不一的褪色現(xiàn)象，處理濃度越高葉片褪色越明顯。其中，鉛離子濃度為0.05mg/L、0.1mg/L和濃度為0.2mg/L的處理組在實(shí)驗(yàn)后期葉片呈現(xiàn)不同程度的枯黃萎蔫，其程度隨著處理濃度的增高而加重。鉛離子濃度為0.2mg/L處理組植株莖由初時(shí)的綠色轉(zhuǎn)為黃綠色，個(gè)別萎蔫葉片甚至有脫落現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所得數(shù)據(jù)利用SPSS軟件，采用單因素方差分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，所得結(jié)果如下表：

表1　不同處理時(shí)間對(duì)測量值的影響

表2　不同鉛離子濃度對(duì)測量值的影響

由表1可以看出，各生理指標(biāo)隨著時(shí)間推移而發(fā)生變化，其中葉綠素總量隨時(shí)間逐漸降低，脯氨酸、丙二醛及可溶性糖含量隨時(shí)間逐漸升高，卡方檢驗(yàn)結(jié)果P值均小于0.05，測量值隨時(shí)間變化顯著；而葉綠素a/b的P值大于0.05，其隨處理時(shí)間降低不明顯。

由表2得知，葉綠素總量和葉綠素a/b的值隨處理濃度升高而下降，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量隨處理濃度升高而不斷增加。5項(xiàng)生理指標(biāo)的卡方檢驗(yàn)結(jié)果P值均小于0.05，可見處理濃度的變化對(duì)各生理指標(biāo)的影響顯著。

圖1　不同濃度Pb2+ 對(duì)葉綠素a含量的影響Fig.1　Effects of different Pb2+ concentrations on Chla contents

2.3鉛脅迫下輪葉黑藻葉綠素含量變化

不同鉛離子濃度對(duì)葉綠素含量的影響見下圖。

據(jù)圖1和圖2所示，經(jīng)鉛離子處理的各濃度組輪葉黑藻植株的葉綠素a和葉綠素b含量是隨著時(shí)間的延長而下降，其中鉛離子濃度為0.01mg/L和0.05mg/L的處理組葉綠素a及葉綠素b含量，先產(chǎn)生了小幅的增加，而后下降，并且濃度0.05mg/L的處理組的葉綠素含量更早下降；鉛離子濃度為0.1mg/L和0.2mg/L濃度組隨時(shí)間延長逐漸下降，不同鉛離子濃度處理組黑藻葉綠素含量下降幅度不同，即隨著鉛離子處理濃度的增大葉綠素a和葉綠素b含量顯著降低。

圖2　不同濃度Pb2+對(duì)葉綠素b含量的影響Fig.2　Effects of different Pb2+ concentrations on Chlb contents

圖3　不同濃度Pb2+對(duì)葉綠素a/b的影響Fig.3　Effects of different Pb2+ concentrationons on Chla/b

由圖3可以看出，葉綠素a與葉綠素b的比值隨著處理時(shí)間段延長而逐漸下降，鉛離子濃度為0.01mg/L時(shí)葉綠素a/b的值變化趨勢較平緩，而后其余3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a/b值則隨著鉛離子培養(yǎng)液濃度的增大下降幅度越來越大。葉綠素a/b比值降低時(shí)，葉綠體2,6-二酚還原能力增強(qiáng)，葉綠體光合磷酸化活性提高，光合能力增強(qiáng)[16],葉綠素a對(duì)活性氧的反應(yīng)較葉綠素b敏感，因而更易分解破壞。

2.4鉛脅迫下輪葉黑藻脯氨酸含量變化

鉛離子濃度為0.1mg/L和濃度為0.2mg/L的處理組脯氨酸含量在第二天出現(xiàn)跳躍性的增加，而后趨于舒緩。高濃度處理組輪葉黑藻的脯氨酸增加幅度明顯大于低濃度組(圖4)。脯氨酸常以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體內(nèi)，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)游離的脯氨酸積累增加[17]，脯氨酸是體內(nèi)重要的代謝調(diào)節(jié)物。在逆境條件下植物體內(nèi)脯氨酸變化對(duì)其抗逆具有重要意義[18]。

圖4　不同濃度鉛離子對(duì)脯氨酸含量的影響Fig.4　Effects of different Pb2+ concentrations on Proline contents

2.5鉛脅迫下輪葉黑藻丙二醛含量變化

丙二醛含量的變化趨勢表現(xiàn)為隨著時(shí)間延長，MDA含量逐漸增大，變化趨勢明顯大于對(duì)照組。不同鉛離子濃度，MDA含量增加幅度不同，低濃度處理組MDA含量的變化相對(duì)較緩，差異不夠顯著。而0.05mg/L、0.1mg/L和0.2mg/L的處理組MDA含量變化趨勢則越來越顯著(圖5)。

圖5　不同濃度鉛離子對(duì)丙二醛含量的影響Fig.5　Effects different Pb2+ concentrations on MDA content

2.6鉛脅迫下輪葉黑藻可溶性糖含量變化

圖6表明，實(shí)驗(yàn)組的輪葉黑藻植株可溶性糖含量第二天和第一天相比都有一個(gè)小幅度的下降，而后都隨時(shí)間的延長而逐漸升高。隨著鉛離子濃度的增大，輪葉黑藻植株可溶性糖含量增加幅度不一，高濃度處理組可溶性糖增加量幅度明顯高于低濃度處理組。

圖6　不同濃度鉛離子對(duì)可溶性糖含量的影響Fig.6　Effects of different Pb2+ concentration on soluble sugar content

3　討　論

鉛離子溶液處理后，無論是從輪葉黑藻的外觀的褪色萎蔫程度或是葉綠素的含量、可溶性糖含量、脯氨酸和丙二醛的含量變化都可看出，重金屬鉛離子對(duì)輪葉黑藻生長的影響顯著。

3.1鉛離子對(duì)輪葉黑藻外觀影響

正常生長的輪葉黑藻植株呈深綠色，受到重金屬離子的脅迫作用后，植株葉片的顏色就會(huì)隨之逐漸改變，由深綠色逐漸變?yōu)辄S綠色，當(dāng)抑制效應(yīng)較強(qiáng)時(shí)，植株會(huì)繼續(xù)褪色至枯黃色，甚至萎蔫；處理濃度與傷害程度呈顯著正相關(guān)。植株褪色的原因可能是，重金屬引起的超量活性氧自由基將葉綠素作為靶分子，致使葉綠索結(jié)構(gòu)破壞、葉片失綠[19，20]。

3.2鉛離子對(duì)輪葉黑藻葉綠素含量影響

葉綠素的含量受多種逆境的脅迫而下降。有研究表明，輪葉黑藻經(jīng)重金屬Cd、Pb處理后，葉綠體膜系統(tǒng)會(huì)遭到破壞，在低濃度處理下，葉綠體的基粒片層稀疏，層次減少；高濃度下，膜系統(tǒng)開始破壞，葉綠體功能喪失[21～23]，從而阻礙了葉綠素的合成。輪葉黑藻在重金屬離子濃度相對(duì)較低的情況下，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的刺激作用，以促進(jìn)其體內(nèi)過氧化氫酶、過氧化物酶等的活性，從而使光合作用在逆境條件下有異常升高的現(xiàn)象[24,25]，這可能是葉綠素合成系統(tǒng)對(duì)低濃度重金屬毒害的一種應(yīng)激反應(yīng)[26]。據(jù)研究，在葉綠素中，葉綠素a對(duì)活性氧的反應(yīng)較葉綠索b敏感[27,28]，葉綠索a不及葉綠素b穩(wěn)定，因而更易分解破壞。

3.3鉛離子對(duì)輪葉黑藻丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)是衡量膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)，丙二醛的含量越高表明細(xì)胞膜的過氧化越快[29]，在正常情況下，活性氧對(duì)植物的毒害作用被活性氧清除系統(tǒng)的活性所平衡，不會(huì)存在超氧自由基的積累[30]。逆境脅迫下，黑藻體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)發(fā)生改變，破壞了活性氧產(chǎn)生和清除的平衡關(guān)系[31]，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷[32]。隨著重金屬離子濃度的加大和處理時(shí)間的延長丙二醛的含量顯著增加，這可能是黑藻對(duì)于脅迫的反應(yīng)。由于POD對(duì)氧自由基的清除防御保護(hù)作用有限，逆境中輪葉黑藻植物體的膜脂過氧化程度加劇，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了POD的保護(hù)能力，造成細(xì)胞內(nèi)自由基累積，引起MDA含量上升。

3.4鉛離子對(duì)輪葉黑藻脯氨酸及可溶性糖含量的影響

與丙二醛一樣，脯氨酸的含量變化也能用來判斷植物組織受到傷害的嚴(yán)重程度。游離脯氨酸在逆境條件下的積累對(duì)植物具有保護(hù)作用，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)[33]、螯合重金屬[34]，抑制脂類過氧化反應(yīng)[35]。實(shí)驗(yàn)中輪葉黑藻脯氨酸含量隨鉛離子處理濃度增加，符合上述理論。

可溶性糖作為植物組織中又一重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要來源于淀粉等碳水化合物的水解[36]。研究表明，逆境脅迫下植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖的增加可以降低植物體內(nèi)的滲透勢，有利于植物體在逆境干旱逆境中維持體內(nèi)正常代謝的所需水分，提高植物的抗逆適應(yīng)性?？扇苄蕴呛吭黾樱梢栽鰪?qiáng)植物體的滲透調(diào)節(jié)能力以抵御重金屬離子脅迫造成的危害。

綜上所述，葉綠素含量的變化是由于重金屬離子對(duì)輪葉黑藻光合作用體系的損害；脯氨酸含量變化反映了重金屬離子對(duì)代謝過程的影響；丙二醛含量的變化反應(yīng)了植物體抗氧化能力及膜脂過氧化程度；可溶性糖含量的變化可以體現(xiàn)重金屬脅迫下細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用。合理有效的利用輪葉黑藻等沉水植物資源，充分發(fā)揮它們?cè)诃h(huán)境保護(hù)中作用，對(duì)水體凈化和修復(fù)及水生生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性的保護(hù)具有重要意義[37]。

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Toxicological Effect of Pb2+on the Growth of Hydrilla Verticillata

HAN Xiao-di1,LIU Dan2

(1.MarineCollege,ShandongUniversutyatWeihai,Weihai，Shandong264209,China；2.ShandongForestGermplasmResourcesCenter,Jinan250014,China)

In this paper, Hydrilla verticillata, as one kind of common perennial submerged plants, were used to explore the effect of Pb2+in water on the growth and the physiological and biochemical indices Different concentrations (0.01, 0.05, 0.10, 0.20 mg/L) of Pb2+were used for comparative study of their effects on Hydrilla verticillata, including changes of their chlorophyll, chlorophyll a/b ratio, soluble sugar, proline, MDA and other indices. The results showed that: leaves of Hydrilla verticillata had presented different degrees of yellow wilting phenomenon with Pb2+, aggravated with the increased concentration of Pb2+； content of chlorophyll a and chlorophyll b and chlorophyll a/b ratio decreased with the increased concentration of Pb2+；content of proline, soluble sugar and MDA increased with the increased concentration of Pb2+. This test showed significant toxicological effects of Pb2+on the growth of Hydrilla verticillata.

Hydrilla verticillata；Pb2+；proline；chlorophyll；malondialdehyde；soluble sugar；Toxicology

2014-12-20

山東省林木種質(zhì)資源中心資助課題(1070432121202、1070413421414)。

韓曉弟(1963-),男,山東萊州市人,1987年畢業(yè)于山東大學(xué)植物學(xué)專業(yè)，理學(xué)碩士，副教授,研究方向?yàn)橹参锷飳W(xué)、植物毒理學(xué)。

X172

A

1001-3644(2015)02-0020-06