劉潔，趙世玉，徐洲，常金明，陳意，范浩軍,2

（1 四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065； 2 四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

引 言

膠原作為天然的動(dòng)物生物質(zhì)資源，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，同時(shí)也是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的結(jié)構(gòu)性蛋白，占體內(nèi)蛋白總量的1/3 左右，而動(dòng)物皮是膠原的主要原料來(lái)源。膠原種類(lèi)繁多，現(xiàn)已證明已發(fā)現(xiàn)的28 類(lèi)膠原至少構(gòu)成了脊椎動(dòng)物中46 種不同的多肽鏈[1]。膠原為生物大分子，相對(duì)分子質(zhì)量約30 萬(wàn)，具有由3 條呈聚脯氨酸Ⅱ型左手螺旋的平行多肽鏈相互纏繞而成的右手超螺旋結(jié)構(gòu)（三股螺旋構(gòu)象）[2]，這種結(jié)構(gòu)賦予其特殊的生物活性，如低的免疫原性、良好的生物相容性、優(yōu)良的吸濕性，能促進(jìn)血小板凝結(jié)，促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、愈合，因而膠原基新型材料如吸附材料、生物醫(yī)用材料、組織工程材料、整形和美容護(hù)膚材料、保健食品等在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，被認(rèn)為是最有用的天然生物質(zhì)材料之一。

當(dāng)前生皮膠原的主要用途，一是制革制膠，二是高值轉(zhuǎn)化為具有生物活性或功能特異性的膠原基新型材料。作為制備生物材料的關(guān)鍵一步，往往需要先將膠原溶解。然而膠原是天然“超分子”，其側(cè)鏈含有豐富的極性基團(tuán)，故可結(jié)合自重10 倍以上的水，而本身卻不溶于水[3]。盡管有少量的溶劑，如稀醋酸溶液、三氟乙醇（TFE）、六氟異丙醇（HFIP）等，因具有捕捉氫鍵、電價(jià)鍵或破壞疏水鍵的能力，可以用來(lái)溶解膠原，但是它們?nèi)匀淮嬖谝恍┤秉c(diǎn)與不足。如即使是在稀酸等良溶劑中，膠原的溶解度也較小且凝膠效應(yīng)明顯，難與其他相態(tài)材料復(fù)合，更難獲得高濃度的膠原溶液（膠原溶液具有高黏度，一般可用的最高濃度為4 mg·ml-1，約0.4%）[4]。特別地，一旦溶解在TFE 或HFIP 中，膠原將會(huì)失去其獨(dú)特的三股螺旋結(jié)構(gòu)，而與明膠無(wú)異[5]。而且這類(lèi)氟醇溶劑飽和蒸氣壓大、易揮發(fā)、腐蝕性及毒性強(qiáng)。顯然，膠原在傳統(tǒng)溶劑中的有限溶解性，尤其是在后兩種溶劑中的變性行為，違背了其作為一種仿生材料的初衷，進(jìn)而阻礙了它在紡絲、醫(yī)用生物材料、食品保健、美容化妝品等方面的高值化利用。因此，找到合適的溶劑來(lái)高效地溶解制備膠原溶液，同時(shí)又盡可能地保留其三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性，是膠原高值轉(zhuǎn)化及利用的前提與基礎(chǔ)。

被視為“超分子”溶劑的離子液體(ionic liquid,IL)主要由無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子與一個(gè)大的電荷呈彌散性分布且高度不對(duì)稱(chēng)的陽(yáng)離子構(gòu)成，是近年來(lái)興起的一類(lèi)極具應(yīng)用前景的綠色溶劑。因其可回收、高熱穩(wěn)定性、可設(shè)計(jì)性、強(qiáng)極性以及良好的生物相容性等獨(dú)特性能，可替代傳統(tǒng)的揮發(fā)性有機(jī)溶劑廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、有機(jī)合成、化工分離、材料制備等領(lǐng)域[6-8]。特別地，離子液體的物理化學(xué)性質(zhì)強(qiáng)烈地依賴(lài)其陰陽(yáng)離子的種類(lèi)以及雜環(huán)的側(cè)鏈烷基長(zhǎng)度，因此改變這些結(jié)構(gòu)參數(shù)將導(dǎo)致離子液體的黏度、揮發(fā)性、催化活性、疏水性和熔點(diǎn)等方面的顯著變化。離子液體中的陽(yáng)離子可作為電子接受體，陰離子可作為強(qiáng)氫鍵受體，故可與膠原分子中的氧原子和氫原子相互作用，進(jìn)而裂解膠原大分子間的氫鍵，近年來(lái)人們?cè)噲D利用離子液體的這種特性來(lái)高效溶解膠原。

周雅文等[9]利用1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽([AMIM]Cl)離子液體溶解脫鉻皮屑，發(fā)現(xiàn)溫度低于100℃時(shí)膠原纖維幾乎不溶解。由于[AMIM]Cl 很稠，影響傳質(zhì)傳熱速率，發(fā)現(xiàn)150℃下溶解50min的溶解量最大。牛鳳英等[10]考察了[AMIM]Cl 對(duì)豬皮粉的溶解效果，發(fā)現(xiàn)溶解溫度高于140℃時(shí)膠原蛋白將發(fā)生嚴(yán)重的降解。本課題組[11]發(fā)現(xiàn)在[BMIM]Cl 中明膠、酪素、皮粉均能溶解，明膠、酪素溶解前后其結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性能都未發(fā)生明顯變化，而皮膠原的熱穩(wěn)定性能略有下降。Meng 等[12]探討了以[BMIM]Cl 為介質(zhì)在100℃的溶解條件下制備多種樣式的膠原/纖維復(fù)合材料的可行性。Wang 等[13]在100℃的條件下用[BMIM]Cl 溶解制備了膠原/纖維素水凝膠珠，因其三維孔狀結(jié)構(gòu)中的氨基酸含有金屬離子的活性結(jié)合位點(diǎn)，可用于2 價(jià)銅離子的吸附。

前人的研究工作多停留在考察高溫下膠原的溶解性以及溶解前后其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，較少涉及離子液體的分子結(jié)構(gòu)差異對(duì)膠原蛋白溶解性能的影響，特別是離子液體中陰離子的構(gòu)造差異對(duì)膠原溶解前后空間結(jié)構(gòu)（尤其是三股螺旋結(jié)構(gòu)）和熱穩(wěn)定性等性能的影響。本工作以氯代1-丁基-3-甲基咪唑離子液體為原料合成了1-丁基-3-甲基醋酸咪唑離子液體，并以?xún)烧邽槿軇┛疾炝四z原在不同陰離子型咪唑離子液體中的溶解特性，采用FTIR、UV、XRD、CD 對(duì)膠原溶解前后的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，同時(shí)對(duì)其溶解前后的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)研究。本工作的目的旨在研究咪唑離子液體陰離子構(gòu)造差異對(duì)膠原溶解行為的影響以及溶解前后膠原結(jié)構(gòu)性能的變化，為在高效提取膠原溶液的同時(shí)最大程度地保留膠原固有的三股螺旋構(gòu)象，提高膠原的生物活性和與其他體系的相容性奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

（1）原料 氯代1-丁基-3-甲基咪唑：化學(xué)純（≥99%），上海成捷化學(xué)有限公司；牛皮皮粉：四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；醋酸銨；4?分子篩：分析純，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；無(wú)水乙醇：化學(xué)純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

（2）儀器 SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵：成都康宇科技有限公司；DZF-6020 型真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-1012 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南予華儀器有限公司；RE52-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海滬西分析儀器廠(chǎng)；Nicolet Is10 傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)Thermo Scientific 公司；LAMBDA25型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)PerkinElmer 公司；DX-1000 型X 射線(xiàn)衍射儀：中國(guó)丹東方圓儀器有限公司；Model 400 型圓二色譜儀：美國(guó)Aviv 公司；TG209F1 型熱重分析儀：德國(guó)耐馳公司。

1.2 離子液體[BMIM]Ac 的制備與表征

采用離子交換法制備醋酸鹽型離子液體[14-15]：將氯代1-丁基-3-甲基咪唑和醋酸銨按摩爾比1:1 分別溶解在無(wú)水乙醇中，將溶解好的氯代咪唑醇溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中。分批加入醋酸銨醇溶液，并在60℃油浴中加熱回流6 h，同時(shí)施以磁力攪拌，生成的NH4Cl 以白色沉淀的形式從醇溶液中析出。真空抽濾，收集濾液，用4? 分子篩處理48 h。減壓蒸餾，除去乙醇，產(chǎn)物為淡黃色的[BMIM]Ac 液體，密封干燥保存。合成反應(yīng)為

1.3 膠原在咪唑離子液體中的溶解

[BMIM]Ac 溶解皮粉的溫度為 50 ℃，而 [BMIM]Cl 在75℃條件下對(duì)皮粉進(jìn)行溶解。實(shí)驗(yàn)中采用油浴加熱、磁力攪拌溶解。皮粉分多次加入，每次加入量為離子液體的1%。膠原在溶液中的溶解度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）根據(jù)公式C=m(膠原)/m(離子液體)×100%計(jì)算。

1.4 再生膠原的制備

在約4℃條件下，將膠原離子液體混合液傾倒在聚四氟乙烯板上，并用無(wú)菌玻璃推板鋪展均勻。將聚四氟乙烯板浸沒(méi)在乙醇沉淀浴中0.5 h，更換乙醇浴，前后多次，直至離子液體完全分散到沉淀浴中。然后取出聚四氟乙烯板，置于真空干燥箱中，常溫減壓干燥，得到恒重的再生膠原半透明膜。

1.5 膠原纖維及再生膠原的性能測(cè)試

（1）紅外光譜分析 對(duì)皮粉及經(jīng)兩種離子液體溶解再生得到的膠原蛋白采用研片的方式制備試樣：取少量溶解前后的皮粉，按溴化鉀/檢測(cè)樣為100:1 的比例混合碾磨，壓片后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，觀察溶解前后蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化情況。儀器分辨率為4 cm-1，掃描頻率32 s-1，波數(shù)范圍500～4000 cm-1。

（2）紫外-可見(jiàn)分光光度分析 將由皮塊酶法提取的膠原蛋白和離子液體溶解再生后的膠原以及明膠分別溶解在0.5 mol·L-1醋酸溶液中，配制成相同濃度的醋酸溶液。用UV-250IPC 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本）在200～500 nm 全波段掃描范圍內(nèi)做紫外分析。

（3）X 射線(xiàn)衍射（XRD）分析 采用DX-1000型X 射線(xiàn)衍射儀測(cè)定皮粉溶解前后的XRD 譜。以CuKα為射線(xiàn)源，管電壓40 kV，管電流30 mA，掃描速率為1(°)·min-1，角度掃描范圍5°～50°。

（4）圓二色譜（CD）測(cè)定 將由此皮粉提取的酶溶性膠原及離子液體溶解再生膠原溶于醋酸溶液中，配置成質(zhì)量濃度為0.1 mg·ml-1的膠原溶液，并于4℃平衡12 h 后，以9000 r·min-1冷凍離心20 min。取上清液加入比色皿中，放入圓二色譜儀中，于190～250 nm 范圍進(jìn)行掃描。

1.6 溶解前后膠原的熱重分析

分別取3～4 mg 溶解前后的皮膠原進(jìn)行熱重分析。實(shí)驗(yàn)采取靜態(tài)TGA 的模式進(jìn)行，測(cè)試樣在氮?dú)獗Ｗo(hù)氣氛下，從40～600℃，以10℃·min-1的速率升溫。對(duì)得到的TGA 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到膠原蛋白的TGA 和DTG 曲線(xiàn)。

1.7 離子液體的回收

將溶有離子液體的乙醇沉淀浴抽濾，收集濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，旋蒸濃縮至燒瓶中不再有氣泡產(chǎn)生為止，隨后將溶液置于真空干燥箱中，于90℃下干燥過(guò)夜。將回收得到的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 進(jìn)行紅外光譜表征，考察回收前后離子液體在結(jié)構(gòu)上是否發(fā)生變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體FTIR 紅外光譜分析

由圖1可知：3424 cm-1吸收峰對(duì)應(yīng)著—OH 的伸縮振動(dòng)，是水的雜質(zhì)峰，因離子液體很容易吸潮。在含有咪唑陽(yáng)離子的離子液體中，3100 cm-1左右的特征譜帶是由咪唑環(huán)上C—H 的伸縮振動(dòng)引起的；2960、2870、1400 cm-1左右的特征譜帶分別歸屬于甲基上C—H 的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)、對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，2936、1460 cm-1左右的特征譜帶則分別歸屬于亞甲基上C—H 的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)；1627、1570 cm-1左右的特征譜帶分別歸屬為咪唑環(huán)中及的伸縮振動(dòng)，1170 cm-1左右的峰歸屬為咪唑的H—C—C 和H—C—N 的彎曲振動(dòng)[16-17]；846、750、620 cm-1左右的譜帶分別歸屬于咪唑的面內(nèi)、面外及其C—N—C 的彎曲振動(dòng)；1012、750 cm-1左右的特征譜帶屬于C—N 的伸縮振動(dòng)。[BMIM]Ac 的羧基COO-系具有多電子π鍵體系，原羰基和C—O 平均化，兩個(gè)C—O 強(qiáng)烈振動(dòng)偶合出現(xiàn)了分離的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)（在1400 cm-1附近）和反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)（在1550～1650 cm-1區(qū)域），而在1700 cm-1附近的伸縮振動(dòng)峰減弱[18]。

圖1 [BMIM]Cl 和 [BMIM]Ac 的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of [BMIM]Cl and [BMIM]Ac

2.2 不同膠原溶液的凝膠性能

圖2列出了兩種離子液體、膠原醋酸溶液及膠原在咪唑離子液體中溶解后的凝膠性能比較。一般而言，低熔點(diǎn)離子液體的陽(yáng)離子具有以下特征：低對(duì)稱(chēng)性、弱的分子間作用力和陽(yáng)離子電荷的均勻分布。也就是說(shuō)，陽(yáng)離子中電荷越分散，分子的對(duì)稱(chēng)性越低，生成化合物的熔點(diǎn)越低[19]。本研究中的1-丁基-3-甲基咪唑?yàn)榉菍?duì)稱(chēng)N,N-二烷基咪唑陽(yáng)離子，電荷彌散性分布，熔點(diǎn)較低。在陽(yáng)離子相同的情況下，陰離子對(duì)離子液體的熔點(diǎn)也有較大影響。大的陰離子與陽(yáng)離子作用力小，易生成熔點(diǎn)低的化合物。相對(duì)Cl-來(lái)說(shuō)，CH3COO-有更大的離子尺寸，因而[BMIM]Ac 具有更低的熔點(diǎn)。概括來(lái)講，離子液體的熔點(diǎn)代表液體間隙的最低極限，其與熱穩(wěn)定性一起確定了溫度間隔，進(jìn)而使離子液體作為溶劑成為 可能。顯然，[BMIM]Ac 較低的熔點(diǎn)為其在低溫溶解膠原纖維提供了可能。

圖2 [BMIM]Cl、[BMIM]Ac、1%膠原醋酸溶液、4%膠原-[BMIM]Ac 混合液和3%膠原-[BMIM]Cl 混合液Fig.2 Appearance of [BMIM]Cl,[BMIM]Ac,1% collagen acetic acid solution,4% collagen-[BMIM]Ac solution and 3% collagen-[BMIM]Cl solution

如圖2(a)所示，[BMIM]Cl 在室溫下為白色固狀，熔點(diǎn)為70℃，而且易吸潮。而圖2(b)為合成的[BMIM]Ac，室溫下為液態(tài)，顏色淡黃，溶液清澈透明，黏度小。圖2(c)為室溫下1%膠原醋酸溶液，展現(xiàn)出高的黏稠性及凝膠狀態(tài)。考慮到醋酸為弱電解質(zhì)，部分解離的Ac-與H+僅能破壞膠原分子間少量的氫鍵與電價(jià)鍵，大部分膠原分子仍然通過(guò)氫鍵聚集，因此低固含量下便呈現(xiàn)高黏性的凝膠狀態(tài)。然而離子液體由完全離子化的[BMIM]+、Ac-（Cl-）構(gòu)成，分別作為電子的受體與質(zhì)子強(qiáng)烈的受體。這些大量離子化的[BMIM]+、Ac-（Cl-）不僅破壞了毗鄰膠原分子間的電價(jià)鍵，而且同時(shí)破壞了分子間的氫鍵鍵合作用，導(dǎo)致膠原在其中具有更高的溶解度，在高固含量時(shí)仍具有良好的流動(dòng)性[圖2(d)、(e)]。

2.3 膠原纖維偏光顯微分析（POM）

膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)主要靠鏈內(nèi)及鏈間氫鍵、離子鍵、范德華力、極性及非極性基團(tuán)間的疏水作用來(lái)維持穩(wěn)定。膠原特有的Gly-X-Y 三肽高度重復(fù)性序列導(dǎo)致螺旋內(nèi)外存在大量的氫鍵，促成膠原纖維規(guī)整性排列，進(jìn)而具備一定的類(lèi)結(jié)晶結(jié)構(gòu)。由于原膠原分子的定向排布，膠原纖維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的各向異性，具有在長(zhǎng)軸的雙折射性，而以Ⅰ型膠原分子為基本結(jié)構(gòu)的真皮層纖維有序體有著介于各向異性晶體和各向同性液體之間的近似液晶態(tài)結(jié)構(gòu)，其對(duì)齊的膠原束類(lèi)似分子相排列[20-21]。

雙折射是晶體的基本特征，偏光顯微鏡觀察是利用光的偏振特性對(duì)具有雙折射性物質(zhì)進(jìn)行研究鑒定的必備手段。如圖3所示，皮纖維顯現(xiàn)出亮度較高的纖維狀，而剛浸沒(méi)于離子液體中的膠原纖維存在大片結(jié)晶光亮區(qū)，表明膠原蛋白分子間錯(cuò)疊的有序結(jié)構(gòu)。但當(dāng)體系受熱溫度上升時(shí)，離子液體開(kāi)始滲入到纖維內(nèi)部，膠原分子間的氫鍵、離子鍵遭到離子液體陰陽(yáng)離子的進(jìn)攻而瓦解，導(dǎo)致膠原分子無(wú)規(guī)則地分布在離子液體中，得到各向同性的分散結(jié)構(gòu)，膠原纖維的雙折射減小乃至全消失。

圖3 膠原纖維(a)、浸沒(méi)于[BMIM]Ac 中的膠原纖維(b)和膠原被[BMIM]Ac 溶解后的離子混合液(c)Fig.3 POM images (×100) of collagen fibers (a),collagen fibers immersed in [BMIM]Ac (b)，and collagen/IL mixture after dissolution by [BMIM]Ac (c)

2.4 膠原溶解前后結(jié)構(gòu)的變化

2.4.1 膠原再生前后的紅外光譜分析 如圖4所示，1658 cm-1處為膠原酰胺Ⅰ帶的伸縮振動(dòng)強(qiáng)峰，1553 cm-1處為酰胺Ⅱ帶N—H 彎曲振動(dòng)吸收峰，1240 cm-1處則出現(xiàn)酰胺Ⅲ帶N—H 的變形峰。酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶是膠原纖維的特征吸收峰。與皮膠原相比，再生后的膠原在3 個(gè)酰胺帶也均有吸收峰，而且峰位幾乎沒(méi)有變化，譜圖中并沒(méi)有新的特征峰出現(xiàn)，表明無(wú)論是用[BMIM]Ac 還是[BMIM]Cl 溶解膠原都沒(méi)有造成膠原一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。

圖4 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解皮纖維后的再生膠原(b)和[BMIM]Cl 溶解皮纖維后的再生膠原(c)的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of native collagen (a),and collagen regenerated from different ionic liquids （b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl）

完整的膠原應(yīng)具有特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)，酰胺Ⅲ帶與1450 cm-1處吸光度的比值常用來(lái)衡量膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)是否完整。據(jù)報(bào)道完整三股螺旋構(gòu)象的膠原應(yīng)該Ⅰ1240/1450≥1（圖4中譜線(xiàn)a)[22]。當(dāng)溶解溫度為50℃時(shí)，[BMIM]Ac 溶解再生后的膠原Ⅰ1240/1450值降到0.93 左右，而75℃下[BMIM]Cl 溶解再生后的膠原Ⅰ1240/1450值則明顯降低至0.83，表明溶解溫度升高膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)受損程度也隨之增大，但相比于膠原的水解產(chǎn)物明膠（約0.6）[23]，此時(shí)的膠原依然維持較高的結(jié)構(gòu)完整性，說(shuō)明兩種離子液體溶解再生后的膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞的程度不高。

2.4.2 膠原溶解前后的紫外光譜分析 膠原的肽鏈中含有眾多生色基團(tuán)，可以在近紫外區(qū)檢測(cè)到吸收峰。圖5是膠原溶解前后的UV 譜圖。

圖5 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)、[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)和明膠（d）的紫外吸收光譜圖Fig.5 UV spectra of solutions of native collagen (a),collagen regenerated from different ionic liquids(b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl),and gelatin (d)

由圖5中譜線(xiàn)a 可知，膠原蛋白的紫外最大吸 收波長(zhǎng)為233 nm，這是膠原蛋白肽鏈中、COOH、CONH2產(chǎn)生的吸收峰，是膠原蛋白的特征峰[10]。無(wú)論是膠原蛋白還是再生后的膠原，其最大吸收波長(zhǎng)都出現(xiàn)在233 nm 附近處，峰型相似，表明經(jīng)咪唑離子液體溶解的膠原一級(jí)結(jié)構(gòu)保留較好，沒(méi)有遭到明顯的破壞。280 nm 為酪氨酸、苯丙氨酸的吸收峰，峰的強(qiáng)弱與膠原蛋白溶液的濃度存在一定關(guān)系。如圖5中譜線(xiàn)a、b、c 所示，膠原蛋白及溶解再生后的膠原蛋白280 nm 處的峰不明顯。對(duì)于同樣濃度的明膠溶液來(lái)說(shuō)，280 nm 處的峰明顯強(qiáng)于其他膠原溶液，原因可能在于明膠是膠原嚴(yán)重水解的產(chǎn)物，膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)已基本喪失殆盡，而且膠原分子鏈在水解過(guò)程中被打斷，使得大量包裹在分子鏈內(nèi)部的酪氨酸、苯丙氨酸殘基暴露出來(lái)，導(dǎo)致280 nm 處的吸收峰明顯增強(qiáng)。膠原及再生膠原的紫外圖譜說(shuō)明，即使是在75℃的條件下用[BMIM]Cl 溶解膠原，膠原仍保留一定的有序結(jié)構(gòu)，破壞程度小于明膠。

2.4.3 膠原溶解前后的XRD 分析 X 射線(xiàn)衍射是測(cè)定膠原空間結(jié)構(gòu)、理解膠原分子三股螺旋構(gòu)象和膠原原纖維軸向排列方式的物理方法。圖6是膠原溶解前后的XRD 衍射譜圖。

圖6 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)的XRD 衍射譜圖Fig.6 XRD patterns of native collagen fibers (a) and collagen regenerated from IL (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

由圖6可以看出，天然皮膠原（皮粉）的X 射線(xiàn)衍射圖上主要有3 個(gè)衍射峰：第一個(gè)是在2θ為7°～8°（約1.3 nm）處，為晶區(qū)產(chǎn)生的衍射峰，這種布拉格間距代表的是組成膠原纖維的分子鏈間橫向距離；第二個(gè)是在2θ=22°附近，出現(xiàn)一個(gè)非常寬的峰，為膠原纖維內(nèi)部眾多結(jié)構(gòu)層次引起的漫散射；第三個(gè)在2θ=31°（約0.29 nm）附近，有一個(gè)小而寬的峰，反映的是膠原螺旋的一個(gè)旋轉(zhuǎn)高度內(nèi)所對(duì)應(yīng)的軸向周期，即典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)[24-26]?？梢钥闯觯偕z原與天然皮膠原纖維的XRD 衍射譜圖形狀相似，但再生膠原在2θ=8°～9°處的衍射峰發(fā)生左移，表明膠原分子鏈間距變大，膠原在溶解過(guò)程中分子鏈彼此分散。[BMIM]Cl 溶解再生膠原在此峰處變寬變小，可能是過(guò)高的溶解溫度使得部分膠原分子鏈發(fā)生了解螺旋，導(dǎo)致結(jié)晶度下降。

2.4.4 膠原溶解前后的圓二色譜 圓二色譜（CD）是研究稀溶液中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的一種方法，主要利用分子對(duì)左、右圓偏振光吸收的不同進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。膠原由具有光學(xué)活性的α-氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成，是具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，其圓二色性主要是活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。由于膠原是一類(lèi)光學(xué)活性蛋白質(zhì)，采取類(lèi)聚脯氨酸Ⅱ型的螺旋構(gòu)象，其圓二色譜特征就是在200 nm 附近有一個(gè)負(fù)吸收峰，而在223 nm 左右有一個(gè)弱的正吸收峰。

圖7 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)的圓二色譜圖Fig.7 CD spectra of native collagen (a) and collagen regenerated from different ionic liquids (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

由圖7可知，膠原及再生膠原都具有典型的膠原圓二色譜特征。但是有研究顯示[27]，膠原完全變性后223 nm 處的正吸收峰完全消失，如膠原的水解物明膠。另有研究表明[28]，膠原螺旋結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致CD 圖譜中峰強(qiáng)度的降低，并且在長(zhǎng)波長(zhǎng)處（約223 nm）出現(xiàn)的峰強(qiáng)度與在短波長(zhǎng)處（約200 nm）出現(xiàn)的峰強(qiáng)度比值（Rpn）會(huì)降低。膠原在[BMIM]Ac 溶解再生后的Rpn值由原來(lái)的0.152 降到了0.127，說(shuō)明再生膠原三股螺旋的完整性稍有所降低，但是[BMIM]Cl 溶解再生后的膠原Rpn 值減少到0.05，說(shuō)明75℃下加熱溶解后的膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生部分解構(gòu)，顯然更高的溶解溫度不利于膠原三股螺旋構(gòu)象的保留。

2.5 膠原再生前后的熱穩(wěn)定性研究

圖8 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl 溶解再生膠原(c)的TG/DTG 曲線(xiàn)Fig.8 TG/DTG curves of native collagen (a) and collagen regenerated from different ionic liquids (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

一般而言，大分子的熱穩(wěn)定性取決于其分子量、空間結(jié)構(gòu)、分子間作用力等因素。從圖8可知，膠原的熱失重主要分為兩個(gè)主要階段：40～150℃為膠原分子間及分子內(nèi)氫鍵的斷裂，同時(shí)伴隨著水分的蒸發(fā)；200～500℃則是膠原多肽鏈的熱分解階段[29]。事實(shí)上，膠原纖維、[BMIM]Ac 及[BMIM]Cl溶解再生膠原15%的質(zhì)量損失溫度分別發(fā)生在290、281 和253℃，表明再生膠原的熱穩(wěn)定性低于原膠原纖維。由于離子液體溶解膠原主要依靠打斷膠原分子間氫鍵及離子鍵的作用力，但是在溶解過(guò)程中不可避免地導(dǎo)致了少量分子內(nèi)氫鍵的破壞，造成再生膠原在低溫區(qū)域熱穩(wěn)定的相應(yīng)下降，特別是[BMIM]Cl 中較高的溶解溫度在一定程度上導(dǎo)致了膠原纖維的部分熱降解。

2.6 溶解機(jī)理

膠原分子的螺旋構(gòu)象以及維持構(gòu)象的各種分子間作用力賦予膠原纖維不溶的性質(zhì)。離子液體能夠溶解膠原的機(jī)理可能主要在于其能夠破壞膠原大分子間的氫鍵及離子鍵，目前可以推斷的是膠原分子上的氧和氫原子與離子液體中的陰陽(yáng)離子基團(tuán)間發(fā)生了相互作用。如圖9所示，在溶解溫度下，離子液體中的陰陽(yáng)離子對(duì)首先解離為自由的[BMIM]+和陰離子，然后這些游離的CH3COO-或Cl-與膠原肽鍵中—NH—上的H 配合，而[BMIM]+與膠原的肽鍵結(jié)合。同時(shí)由于靜電力的作用，帶有相反電荷的[BMIM]+、Ac-（Cl-）分別與膠原側(cè)鏈離子化的COO-與NH+3相互吸引鍵合，破壞了COO-與NH+3間原有的電價(jià)鍵。[BMIM]+、Ac-（Cl-）與膠原分子間新形成的氫鍵與離子鍵打斷了膠原分子間 的氫鍵及離子鍵，最終導(dǎo)致膠原鏈能夠自由地運(yùn)動(dòng)并溶解于離子液體中。

圖9 膠原纖維在咪唑離子液體中的溶解原理Fig.9 Possible dissolution mechanism of collagen in imidazolium ionic liquids

相較于[BMIM]Cl，[BMIM]Ac 溶解膠原纖維的條件溫和得多，這不僅由于醋酸鹽的咪唑離子液體有著更低的熔點(diǎn)及黏度，還在于其有著更強(qiáng)的質(zhì)子接受能力。有研究表明，Kamlet-Taftβ參數(shù)可作為反映溶劑質(zhì)子接受能力的參數(shù)。一般而言，溶劑的β參數(shù)越大，其接受質(zhì)子的能力就越強(qiáng)。很明顯，陽(yáng)離子相同的離子液體，其接受氫鍵的能力（β參數(shù)值）隨陰離子不同而不同。根據(jù)先前的研究，由于醋酸根的存在，[BMIM]Ac 的β參數(shù)值為1.2，幾乎是[BMIM]Cl（β=0.83）的1.5 倍左右[30]。因此，[BMIM]Ac 展現(xiàn)出更強(qiáng)的質(zhì)子接受能力，能夠破壞膠原聚集體分子間廣泛且有序組織存在的大量氫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致膠原在更低的溫度下溶解，避免了膠原的三股螺旋在受熱溶解過(guò)程中的解構(gòu)。此外，當(dāng)[BMIM]Ac 滲透到膠原纖維間隙內(nèi)時(shí)，其較大的陰陽(yáng)離子空間體積降低了膠原分子的內(nèi)聚作用（削弱、破壞化學(xué)鍵）并增加了其親溶劑性，因而所制備的膠原溶液具有更高的固含量和流動(dòng)性。

2.7 離子液體回收前后的紅外光譜分析

離子液體能夠回收與再利用是其主要優(yōu)點(diǎn)之一，這樣離子液體就可以循環(huán)使用，從而降低生產(chǎn)成本。離子液體的沸點(diǎn)較高、熱穩(wěn)定性好、飽和蒸氣壓接近零，因而沉淀浴中的離子液體和乙醇可以通過(guò)減壓蒸餾操作進(jìn)行分離。本研究對(duì)回收后的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 進(jìn)行了紅外光譜表征，考察回收前后離子液體在結(jié)構(gòu)上是否發(fā)生變化。由圖10可知，除3424 cm-1附近處水的雜質(zhì)峰變寬外（可能原因在于皮膠原溶解過(guò)程中帶入的一部分結(jié)合水在蒸餾過(guò)程中沒(méi)有除盡），離子液體回收前后的紅外譜圖基本一致。這說(shuō)明回收后的離子液體仍然保持其原有的結(jié)構(gòu)，可以重復(fù)利用。

圖10 [BMIM]Cl(a)、回收后的[BMIM]Cl(b)、[BMIM]Ac(c)和回收后的[BMIM]Ac(d)的紅外光譜圖Fig.10 FTIR spectra of [BMIM]Cl (a),recovered [BMIM]Cl (b),[BMIM]Ac (c),and recovered [BMIM]Ac (d)

3 結(jié) 論

（1）合成的1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體（[BMIM]Ac）與咪唑氯鹽[BMIM]Cl 相比，具有常溫流動(dòng)性好、黏度低和氫鍵接受能力強(qiáng)等特點(diǎn)，離子液體所制備的膠原溶液具有更高的固含量和良好的流動(dòng)性。

（2）POM 觀察顯示膠原的晶態(tài)結(jié)構(gòu)在離子液體溶解過(guò)程中的變化。離子液體破壞了膠原分子間的氫鍵，導(dǎo)致以氫鍵作用為基礎(chǔ)堆疊形成的結(jié)晶構(gòu)象瓦解，溶解后的膠原晶態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞（亮區(qū)完全消失），分子無(wú)規(guī)則地散布于離子液體中。

（3）膠原在咪唑離子液體中的溶解與再生過(guò)程并沒(méi)有導(dǎo)致其紅外、紫外譜圖的明顯變化，表明膠原的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，其溶解屬于直接溶解，溶解機(jī)理為構(gòu)成離子液體的陰、陽(yáng)離子削弱了膠原分子間的氫鍵及離子鍵作用。

（4）FTIR、XRD、CD 分析表明，離子液體溶解再生后的膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生部分松散，但在相同咪唑陽(yáng)離子的情形下，由于Ac-具有更強(qiáng)的質(zhì)子接受能力以及更大的離子尺寸所帶來(lái)的更低熔點(diǎn)與溶解溫度，經(jīng)[BMIM]Ac 溶解再生后的膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)保留相對(duì)完整，螺旋保留度遠(yuǎn)高于[BMIM]Cl 溶解再生的膠原。

（5）熱重分析表明再生后的膠原熱分解溫度和熱解峰均低于天然膠原纖維，原因在于皮膠原在溶解過(guò)程中部分空間結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)發(fā)生了改變，特別是[BMIM]Cl 過(guò)高的溶解溫度可能導(dǎo)致膠原的部分解螺旋，相較于氯代咪唑鹽，醋酸咪唑鹽溶解再生的膠原具有更高的熱穩(wěn)定性。

（6）回收后的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，仍可繼續(xù)使用，降低了反應(yīng)成本。

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