李琦，成莉鳳，曾潔，劉朝陽，劉正初，*

(1.湖南農業(yè)大學植物保護學院，長沙410128;2.中國農業(yè)科學院麻類研究所，長沙410205;3.湖南利爾康生物股份有限公司，湖南岳陽414100)

纖維作物的生物脫膠 (例如苧麻脫膠)關鍵控制因素之一就是果膠酶[1]。果膠酶是一類能夠降解果膠物質的生物酶的總稱，是一種重要的工業(yè)酶制劑。果膠酶還廣泛應用于果汁澄清、植物提取、廢水處理、紙漿漂白[2]等工業(yè)領域。按照作用底物的不同，果膠酶可以分為果膠甲基半乳糖醛酸酶 (PMG)、聚半乳糖醛酸酶 (PG)、果膠裂解酶 (PL)、聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)、果膠酯酶或果膠甲酯酶 (PE)、原果膠酶等。按照酶作用的最適pH情況，又分為酸性果膠酶、中性果膠酶與堿性果膠酶。為適應工業(yè)化應用的高要求，果膠酶的研究熱點正逐步由菌種篩選、酶學性質測定、分離純化研究轉向基因工程、蛋白質工程等分子生物學內容。發(fā)掘天然優(yōu)秀菌株中的優(yōu)質果膠酶基因，是分子生物學的基礎工作之一。

實驗室篩選到了擁有14個果膠酶基因的麻類脫膠高效菌株DCE01。為了更好的研究各果膠酶的特性，采用PCR技術克隆了該菌株的一個果膠酶基因Pel4I8，將其與大腸桿菌表達載體pET－28a連接，在E.coli BL21(DE3)中進行了表達。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株DCE01由中國農業(yè)科學院麻類研究所工程酶項目組提供;E.coli BL21(DE3)購自Novagen公司;載體pET－28a購自TransGen公司;聚半乳糖醛酸鈉、橘子果膠 (不同酯化度)購自Sigma公司;高保真聚合酶購自TransGen公司;UNIQ－10柱式細菌基因組等試劑盒購自上海生工公司;DNA Marker購自Tiangen公司;其他常規(guī)生化試劑均為分析純，購自國藥集團。

PCR儀購自BioRad公司;SPX－250B型生化培養(yǎng)箱購自上海博訊公司;LDZX－50KBS型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

DCE01菌種的活化[3]方法:從斜面保藏菌種挑取一環(huán)接種到5mL改良肉湯培養(yǎng)基，充分懸勻，35℃ 靜置培養(yǎng)5－8h。稀釋涂布固體改良肉湯培養(yǎng)基，35℃靜置培養(yǎng)18－20h，分離單菌落。挑選生長旺盛的單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基，35℃，180r/min培養(yǎng)15－18h，供基因組DNA提取或其他用途。

1.2.2 基因組DNA的提取

參照UNIQ－10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行。

1.2.3 果膠酶pel4I8基因的擴增

采用軟件Primer premier 5設計引物。上游引物帶BamH I酶切位點，下游引物帶Hand III酶切位點。

以DCE01菌株基因組DNA為模板，擴增體系參照試劑說明書。擴增參數設置為:95℃ 預變性4.0 min，94℃變性30s、55℃退火30 s、72℃延伸1.0 min，共30個循環(huán)，72℃保溫10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產物。質粒提取、DNA酶切、連接、轉化、DNA片段回收等操作按相關試劑盒說明進行。

1.2.4 果膠酶的誘導表達及粗酶液的制備

挑取陽性基因工程菌株接種培養(yǎng) (培養(yǎng)條件:37℃、220 r/min)。當OD600達到0.6，添加IPTG進行誘導。發(fā)酵液在3500 r/min，4℃的條件下離心10 min，分別收集菌體和上清液。上清液即為胞外酶液。

用適量預冷的生理鹽水洗滌菌體并重懸，在4℃下用超聲波破碎儀破壁后，14℃、10000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為胞內酶液。

1.2.5 SDS－PAGE電泳

采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。根據蛋白質樣品的濃度，上樣量為5.0－20.0μL。濃縮膠的電壓為100V，電流10mA。待進入分離膠后，電壓不變，電流調節(jié)為25mA。

1.2.6 果膠酶活力單位定義

50℃、pH值9.0條件下，底物每分鐘釋放出相當于1.0μmol半乳糖醛酸的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位，以“U/mL”表示。

1.2.7 果膠酶酶學性質分析

在50℃下測定重組果膠酶在pH 7.5－11.0時的酶活性，確定其最適pH值;在pH 9.0條件下，分別測定其在40－65℃條件下的酶活。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

以基因組DNA為模板，獲得的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示:果膠酶基因Pel4I8電泳條帶清晰，目的基因克隆成功。測序結果標明，該基因含有1632個堿基。

圖1 果膠酶基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of pectate lyase gene

2.2 質粒轉化與酶切

提取轉化后陽性菌株的質粒，并在37℃酶切30 min。以質粒DNA為模板進行PCR鑒定。用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物及陽性克隆菌種的質粒PCR產物。結果表明:果膠酶基因Pel4I8已經轉化成功，條帶大小與目標基因相符。

圖2 質粒PCR鑒定與擴增檢測Fig.2 Detection of recombinants by PCR

2.3 誘導產酶結果

重組菌株經IPTG誘導8h、21h后的蛋白質SDS－PAGE電泳結果表明:第21h的條帶較第8小時的明顯，這說明蛋白的表達量隨著誘導時間的延長而增多。果膠酶Pel4I8基因編碼543個氨基酸，預測的分子量約為63kDa。

圖3 果膠酶SDS－PAGE電泳Fig.3 SDS－PAGE of recombinant pectate lyase

2.4 堿性果膠酶的酶學性質

生物酶的作用隨著溫度和pH的變化而變化，一般來說，溫度越高，催化效果越好，但是溫度過高，又會破壞蛋白質的結構，甚至使蛋白質失去活性。結果顯示，該酶的最佳反應溫度為55℃、最佳反應pH為pH 9.5。

圖4 溫度對重組果膠酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant pectate lyase

圖5 重組果膠酶的pH值穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of recombinant pectate lyase

工業(yè)應用中，人們常常通過比較酶活來評價一個酶的催化效率。然而，酶活的檢測往往受到底物等多種因素的影響。這在果膠酶Pel4I8上尤為明顯。分別采用四種酯化度各不相同的橘子果膠為底物，檢測到的酶活相差較大。用酯化程度在55%－70%的橘子果膠作底物檢測時酶活最高，以酯化程度≥85%的橘子果膠為底物時，幾乎檢測不到酶活。

圖6 不同底物對酶活力的影響Fig.6 Effect of substrates on enzyme activity

3 討論

自然界中的產果膠酶微生物往往可以分泌多種不同類型的果膠酶，這些酶的酶學特性往往有很大的差別，認真分析和研究這些差異性，既是拓展工業(yè)酶精細化應用的需要，也是開發(fā)新型高效酶制劑的基礎。酶法脫膠中更偏向于選擇堿性果膠酶而不是酸性果膠酶，因為堿性環(huán)境下纖維素降解會受到抑制[4]。在麻類脫膠工序中，果膠酶與果膠酶之間有協(xié)同作用，果膠酶與其它酶復合使用，更能降低能耗，提高生產性能。Kaur等在紅麻生物制漿中利用果膠酶與木聚糖酶協(xié)同作用，提高了紙漿性能[5]。因此，實際應用中，既要考慮果膠酶的酶學特性，還要考慮起協(xié)同作用的其它酶制劑的酶學特性，只有各酶種的特性類似，組合使用時才能發(fā)揮最佳效率，否則，會或多或少降低某一種酶的催化效率，造成浪費。

進行蛋白表達時，有些胞內酶不能正確折疊和修飾，還會形成包涵體，即使純化出來也不一定能成功復性[6]。據報道，采用pEASY－E1載體進行該酶基因的表達時，尚未檢測到胞內酶活性和胞外酶活性[3]，而采用pET－28a載體時，兩者均檢測到了活性。表達載體的選擇可能對該酶的表達影響較大。

通過Blast序列分析發(fā)現，在核酸序列上，Pel4I8基因與來自Dickeya dadantii 3937的pelW基因[7]相似程度為93%，有109個差異點，而在氨基酸序列上的差異性要小一些，有9個氨基酸不同，相似度為97%。

據報道，盡管不同來源的果膠酶酶學性質存在差異，但是，大部分堿性果膠酶最適pH值為8.0～l0.0，最適溫度范圍為50～60℃[8]。Li Zuming等[9]報道的果膠酶最適反應pH值為10.0;徐偉等報道的果膠酶最適pH值為9.0～9.5，在pH 7.0～10.0之間催化性質較穩(wěn)定;最適作用溫度范圍為45～55℃[10]。本研究中的果膠酶最適pH值為9.5，但在pH 9.0及10.0時，酶活僅為高峰時的61%和42%，這說明外部pH對酶的影響較大。在40－55℃溫度區(qū)間，酶活穩(wěn)定上升，最適溫度為55℃，這與已報道的研究相吻合。

工業(yè)應用中，用酶環(huán)境較復雜，溫度和pH一般都有一定的波動范圍，這對工業(yè)酶的推廣與普及是一個挑戰(zhàn)。設計一個在較寬的溫度和pH范圍內相對穩(wěn)定的酶蛋白是今后工業(yè)酶制劑開發(fā)的一個方向，此外，還將加強提高酶的表達量及催化效率方面的研究，為該酶的工業(yè)化應用打下基礎。

[1]鄭科，劉正初，段盛文，等.果膠酶在麻類脫膠中的應用及其作用機理[J].生物技術進展，2012，2(6):404－410.

[2]Murad HA，Azzaz HH.Microbial pectinases and ruminant nutritior[J].Research Journal of Microbiology，2011，6(3):246－269.

[3]成莉鳳.DCE－01菌株果膠酶基因克隆與表達及其多樣性研究[D].北京:中國農業(yè)科學院，2013.

[4]白延坤，劉秉鉞，何連芳.韌皮纖維生物脫膠的研究進展[J].造紙科學與技術，2006，25(2):34－38.

[5]Kaur A，Mahajan R，Singh A，et al.Application of cellulase－free xylano－pectinolytic enzymes from the same bacterial isolate in biobleaching of kraft pulp [J].Bioresour Technol，2010，101(23):9150 －9155.

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