姜穎，夏尊民，韓承偉，李秋芝，趙越，曹洪勛

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319)

大麻 (Cannabis Sativa L.)，是大麻科 (Cannabinaceae)大麻屬 (Cannabis)一年生草本植物，大麻又分為工業(yè)用大麻和毒品大麻，現(xiàn)在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大麻為工業(yè)用大麻，工業(yè)用大麻是指大麻中的大麻酚物質(zhì)中的四氫大麻酚 (THC)含量低于0.3%的大麻[1－2]。工業(yè)大麻渾身是寶，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，如工業(yè)大麻籽就具有很好的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[3];近年來，隨著人們回歸自然，更加重視環(huán)保和健康等理念，對(duì)工業(yè)大麻的產(chǎn)品特性有了深入的了解，世界各國對(duì)工業(yè)大麻資源的利用與開發(fā)越來越重視。

目前，國內(nèi)工業(yè)大麻品種多數(shù)為自留自選的農(nóng)家品種，品種混雜退化、纖維產(chǎn)量低、長麻率僅在10%左右。這導(dǎo)致農(nóng)民收入及原料加工效益低，進(jìn)而直接影響到工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的振興。工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展壯大的技術(shù)瓶頸是推廣種植高纖、優(yōu)質(zhì)、低毒、高產(chǎn)、高抗新品種。我國工業(yè)大麻新品種選育主要采用引種、系選、雜交、雜種優(yōu)勢、物理誘變等育種方法，其存在周期長、田間選擇難度大、抗源不足等問題。生物工程技術(shù)育種是創(chuàng)新工業(yè)大麻資源，培育優(yōu)質(zhì)新品種的先進(jìn)技術(shù)。但工業(yè)大麻單倍體、多倍體和細(xì)胞工程育種研究在我國尚屬空白。因此，工業(yè)大麻高效再生體系的建立對(duì)工業(yè)大麻的遺傳轉(zhuǎn)化、單倍體培養(yǎng)等具有重要意義，為工業(yè)大麻生物工程技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龍麻一號(hào)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒

挑選成熟、飽滿、有光澤的工業(yè)大麻種子，先用75%的乙醇浸泡2min，然后用無菌蒸餾水沖洗3～4遍;再用5%的次氯酸鈉溶液 (NaClO)浸泡處理 (C1)0min，(C2)10min，(C3)15min，(C4)20min，(C5)25min，無菌蒸餾水沖洗5遍，沖洗過程中不斷攪動(dòng)種子，充分清除殘留的次氯酸鈉:然后在無菌條件下浸泡16～24h，種皮吸水脹裂后，用無菌濾紙吸干種子表面液體，接種于MS(無激素)固體培養(yǎng)基 (以下所有培養(yǎng)基:瓊脂0.8%，3%蔗糖，pH 5.8)上，每處理接種20粒種子，重復(fù)3次。在溫度為24±1℃、光照強(qiáng)度1800～23001ux、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)10天之后 (隨時(shí)觀察)，此時(shí)實(shí)生苗大約長至3～5cm，統(tǒng)計(jì)各處理的種子發(fā)芽情況、污染情況及無菌苗狀態(tài)。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將萌發(fā)10天后的工業(yè)大麻實(shí)生苗的下胚軸 (切成0.5～0.8cm的小段)作為外植體，接種于不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織形成，接種20塊，設(shè)置3次重復(fù)，在溫度為24±1℃、黑暗條件下培養(yǎng)，隨時(shí)觀察，培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:(Y1)MS+1.0mg/L 6－BA+1.0mg/L NAA;(Y2)MS+1.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA;(Y3)MS+2.0mg/L 6－BA+1.0mg/L NAA;(Y4)MS+2.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA。

1.2.3 不定芽的分化

將下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的分化，接種10塊，設(shè)置3次重復(fù)，在溫度為24±1℃、光照強(qiáng)度1800～23001ux、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，繼代頻率為每兩周一次，隨時(shí)觀察，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

不定芽分化培養(yǎng)基:(B1)MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA;(B2)MS+2.0mg/L KT+0.5mg/L NAA;(B3)MS+2.0mg/L 2，4－D;(B4)MS+2.0mg/L 2，4－D+1.0mg/LNAA。

1.2.4 生根培養(yǎng)

待不定芽長至2～3cm左右時(shí)，將其從基部切下，插入不同生根培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行伸長和誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)40天后統(tǒng)計(jì)生根率。

生根培養(yǎng)基:(S1)1/2MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA;(S2)1/2MS+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA;(S3)1/2MS+0.05mg/L IBA+0.1mg/L NAA;(S4)1/2MS+0.1mg/L IBA+0.05mg/L NAA。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

愈傷組織誘導(dǎo)率 (%)=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))x100

不定芽分化率 (%)=(分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))x100

生根率 (%)=(生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù))x100

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS分析軟件和Excel 2007進(jìn)行分析處理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間對(duì)種子消毒的影響

研究采用5%的次氯酸鈉溶液 (NaClO)作為消毒劑，種子接種前采用75%的乙醇結(jié)合次氯酸鈉對(duì)種子進(jìn)行消毒，設(shè)計(jì)的工業(yè)大麻種子滅菌處理的試驗(yàn)，結(jié)果表明:75%乙醇浸泡2min后，再用5%的次氯酸鈉溶液 (NaClO)浸泡處理15min，出苗率達(dá)到91.97%，沒有污染的情況而且無菌苗的生理狀態(tài)很好，葉片舒展，挺拔，整齊。如表1所示 (種子發(fā)芽率為90.00% ±1.00%)。

表1 5%的次氯酸鈉溶液 (NaClO)浸泡處理時(shí)間對(duì)種子消毒的影響Tab.1 Effect of 5%NaClO at different treatment time on hemp seed disinfection

2.2 最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定

將萌發(fā)10天后的工業(yè)大麻實(shí)生苗的下胚軸 (切成0.5～0.8cm的小段)作為外植體，在不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基下的愈傷組織誘導(dǎo)率的比較數(shù)據(jù)見表2。研究結(jié)果表明:Y2培養(yǎng)基 (MS+1.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA)的愈傷組織誘導(dǎo)率最高 (91.67%)，且誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)間最短，而且愈傷組織生長情況較好。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effect of different plant growth regulators on the induction rate of callus

2.3 最適不定芽分化培養(yǎng)基的確定

將愈傷組織轉(zhuǎn)入不同激素組合的不定芽分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)約10天后細(xì)胞團(tuán)表面開始出現(xiàn)綠芽點(diǎn)，30天后達(dá)到分化高峰，并對(duì)不定芽分化率進(jìn)行比較 (表3)。結(jié)果表明:B1培養(yǎng)基 (MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA)的不定芽分化率最高 (76.67%)，由此說明，2，4－D的使用可能會(huì)抑制工業(yè)大麻不定芽的分化，生長素NAA搭配適宜濃度的細(xì)胞分裂素KT對(duì)工業(yè)大麻下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行不定芽分化產(chǎn)生促進(jìn)作用。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽分化的影響Tab.3 Effect of different plant growth regulators on differentiation rate of adventitious bud

2.4 不同激素組合對(duì)生根的影響

待不定芽長至2～3cm左右時(shí)，將其從基部切下，插入不同生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20天左右不定芽開始生根，培養(yǎng)40天后統(tǒng)計(jì)生根率。研究表明:不同激素組合對(duì)根的誘導(dǎo)率有較大影響，以1/2MS+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA激素組合效果較好，根的誘導(dǎo)率達(dá)到75%(如圖1所示)。

圖1 不同激素組合對(duì)生根的影響Fig.1 Effect of different plant growth regulators on rooting

圖2 工業(yè)大麻組織培養(yǎng)的研究過程Fig.2 The process of tissue culture of industrial hemp(Cannabis sativa L.)

3 結(jié)論與討論

工業(yè)大麻離體培養(yǎng)過程中，無菌苗的獲得是關(guān)鍵，選擇適宜的消毒劑和處理時(shí)間，既有良好的除菌效果，大大降低了初始污染率，又獲得了生長狀態(tài)更好的實(shí)生苗[4]。NaClO會(huì)影響植物幼苗的生長，還可能促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生[5]。所以，工業(yè)大麻種子消毒選用75%乙醇浸泡2min后，再用5%的次氯酸鈉溶液 (NaClO)浸泡處理15min。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)國內(nèi)外工業(yè)大麻再生體系的培養(yǎng)基做了統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn):MS培養(yǎng)基是應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基[4]。所以，本研究選用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。植物生長調(diào)節(jié)劑用量雖然微小，但卻是不可或缺的，它可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育進(jìn)程、分化方向和器官發(fā)生[6]。NAA是光譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根等作用。工業(yè)大麻新品種龍麻一號(hào)適合的再生條件為:1.0mg/L 6－BA和0.5mg/L NAA組合的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到91.67%;1.0mg/L KT和0.5mg/L NAA組合較適合不定芽的分化，不定芽分化率達(dá)到76.67%;0.05mg/L IBA和0.05mg/L NAA激素組合生根能力較好，生根率達(dá)到75%。

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[2]Avico U，Pacifici R，Zuccaro P.Variations of tetrahydro－cannabinol content in Cannabis plants to distinguish the fiber－type from drugtype plants [J].Bull Narc，1985，37(4):6l一65.

[3]姜穎，韓承偉，李秋芝，等.工業(yè)大麻籽的開發(fā)利用[J].黑龍江科學(xué)，2014，5(2):6－7.

[4]姜穎，韓承偉，李秋芝，等.工業(yè)大麻 (工業(yè)大麻)組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(1):7－8.

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[6]賈婉琪.亞麻高效再生體系優(yōu)化及抗除草劑bar基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].湖南:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，2011.