付瑞敏 康治華 彭瑞強(qiáng) 陳五嶺

摘要：從長慶油田石油污染土壤中分離得到一株產(chǎn)生生物表面活性劑的高效石油烴降解菌。通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)研究，篩選出的菌株CQ6被鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。為了增強(qiáng)該菌降解石油烴的能力，對其進(jìn)行He-Ne激光誘變，獲得6株突變株，通過檢測其表面張力、排油圈直徑和烴降解率，降解石油烴能力最強(qiáng)且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株CQ66被挑選出來。本研究表明，He-Ne激光誘變育種技術(shù)可有效改良石油烴降解菌，該手段對修復(fù)石油污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)鍵詞：石油烴降解菌；表面活性劑；He-Ne激光誘變；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0404-03

隨著石油工業(yè)的快速發(fā)展，在石油勘探、開采、運(yùn)輸及煉制等過程都會出現(xiàn)原油的泄漏，從而對土地和鄰近水體造成嚴(yán)重污染[1]。這些原油可通過生物學(xué)或非生物學(xué)途徑而逐步降解。研究表明，消除石油烴污染的各個因素中，微生物降解具有重要作用，當(dāng)前已報道有多種微生物具有降解石油烴并產(chǎn)生表面活性劑的能力[2-4]。李倩等制備石油烴降解菌劑并將其應(yīng)用于溢油岸灘的生物修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過28 d的生物修復(fù)，其石油烴降解率最高達(dá)45.07%[5]?？梢姴捎矛F(xiàn)代育種技術(shù)選育石油烴降解菌對于石油污染區(qū)域的生物修復(fù)具有極為重要的應(yīng)用價值。 激光可通過光、電、熱和電磁等綜合作用引起菌體細(xì)胞基因發(fā)生改變，從而使所產(chǎn)生的酶發(fā)生激活或鈍化[6]。低能量的He-Ne激光作用于菌體細(xì)胞，可促進(jìn)菌體細(xì)胞生長進(jìn)而提高代謝物產(chǎn)量，當(dāng)前引起了微生物育種者的廣泛關(guān)注[7]。本研究針對長慶油田石油污染土壤，進(jìn)行了石油烴高效降解菌的分離、鑒定，并通過He-Ne激光輻射誘變育種，選育出一株遺傳性能穩(wěn)定的高效石油烴降解菌，以期為石油污染土壤的生物修復(fù)提供數(shù)據(jù)參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種來源

從長慶油田石油污染土壤中提取。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 無機(jī)鹽培養(yǎng)基 MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，F(xiàn)eCl3 0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2.2 選擇培養(yǎng)基 將2 g原油抽濾滅菌后加到上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，即為液體選擇培養(yǎng)基，也叫原油發(fā)酵培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂制成相應(yīng)的固體選擇培養(yǎng)基，即為油平板。試驗(yàn)所用原油采自長慶油田G010-18 井。

1.2.3 LB培養(yǎng)基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，即為液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基的瓊脂添加量控制在15%～18%。

1.2.4 復(fù)壯培養(yǎng)基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，葡萄糖50 mmol/L

1.3 試驗(yàn)儀器

He-Ne激光發(fā)生器（波長632 nm，功率10 mW），由西北大學(xué)光電廠生產(chǎn)；WZY-1自動液體表面張力儀，由上海衡平制造廠生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株培養(yǎng)

菌株分離自長慶油田G010-18 井周邊污染土壤。將100 mL選擇液體培養(yǎng)基加入到250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，而后稱取5 g污染土壤置于其中，透氣封口膜封住瓶口，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d。

2.2 菌株篩選與分離

2.2.1 初篩 采用梯度稀釋法，將培養(yǎng)后的菌液用無菌水連續(xù)稀釋101～107倍，取10-5、10-6、10-7的梯度稀釋液分別涂布于以石油烴為唯一碳源的油平板上，每個稀釋度均做3個平行試驗(yàn)，將其置于37 ℃培養(yǎng)3 d，能在油平板上生長的就是石油烴降解菌。將石油烴降解菌通過平板劃線獲得單菌落，將其轉(zhuǎn)至斜面，4 ℃保存。

2.2.2 復(fù)篩 為了進(jìn)一步檢測石油烴降解菌對石油烴的降解能力，采用表面張力檢測、排油圈[8]和烴降解率[9]等3種方法進(jìn)行復(fù)篩。（1）表面張力檢測[8]。將篩選出的石油烴降解菌菌株活化，以2%的比例接入葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，使用張力儀檢測發(fā)酵液的表面張力。（2）排油圈[8]。取90 mm培養(yǎng)皿，加入 50 mL 去離子水，滴加0.1 mL液體石蠟于水面，石蠟中心加入10 μL發(fā)酵液，發(fā)酵液會將石蠟擠向四周形成圓圈，菌株所產(chǎn)生表面活性劑的量及活性同該圓圈的直徑成正比。通過對比各菌株所形成的排油圈，選取排油圈直徑最大的菌株作深入研究。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。（3）烴降解率[9]。將石油烴降解菌菌液以10%的比例接入50 mL的原油發(fā)酵培養(yǎng)基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，按照文獻(xiàn)[9]中方法測定培養(yǎng)液中原油降解率，計(jì)算石油烴降解率。

降解率（D）=（m1-m7）/m1×100%。

式中：m1為初始發(fā)酵培養(yǎng)基中原油含量；m7為培養(yǎng)7 d殘留油含量。

經(jīng)過上述試驗(yàn)，即可選出降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株。

2.3 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[10-11]對所選的降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定（包括革蘭氏染色、芽孢染色和大小測定等），并參照微生物試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對該菌進(jìn)行生理生化測定（包括過氧化氫酶反應(yīng)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)和耐鹽性試驗(yàn)等），上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.4 16S rDNA序列分析

參照Fani等的方法[12]，采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA 的PCR擴(kuò)增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），該引物合成自上海生工。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，共計(jì)30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將所得PCR產(chǎn)物回收純化并提交目的片段至上海生工進(jìn)行基因測序，所得序列采用MEGA 3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹的聚類穩(wěn)定性進(jìn)行1 000次自導(dǎo)檢驗(yàn)[13]。

2.5 He-Ne激光誘變和突變株的選育

2.5.1 誘變前的活化

將所選菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h后，用5 mL無菌生理鹽水沖洗斜面后將其置于三角瓶中（內(nèi)含玻璃珠），充分振蕩混勻，采用光電比濁計(jì)數(shù)法將菌懸液的D值調(diào)節(jié)至0.986，使其濃度為108 CFU/mL。

2.5.2 He-Ne激光誘變[14]

取2 mL菌懸液分別置于無菌試管中，將 He-Ne 激光的輸出功率調(diào)節(jié)為10 mW，照射距離調(diào)節(jié)為 25 cm，照射時間為5、10、15、20、25 min，以原菌液為對照，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.5.3 誘變菌培養(yǎng)

無菌條件下取1 mL激光照射后的菌液，將其置于裝有9 mL無菌水的試管中，作為10-1，振蕩混勻后再以同樣方法將其稀釋至10-5、10-6、10-7，從3個梯度的稀釋液中各取0.2 mL涂平板，每個稀釋度設(shè)3個平行，37 ℃ 培養(yǎng)20 h后，以原菌懸液作為對照，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和菌落計(jì)數(shù)。

2.5.4 存活率和正突變率的計(jì)算

將激光誘變后的菌懸液用復(fù)壯培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為280 r/min 、37 ℃下培養(yǎng)6 h，而后使用梯度稀釋法將其稀釋至10-6，分別取0.1 mL 10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布在油平板上，以未照射的菌液為對照，37 ℃、96 h后觀察生長狀況，并計(jì)算存活率和正突變率：

存活率=誘變后活菌數(shù)/誘變前活菌數(shù)×100%；

正突變率=正突變菌株數(shù)/誘變后活菌數(shù)×100%。

2.5.5 挑取優(yōu)良突變株

通過菌落形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)，從誘變后的菌株中挑選出菌落形態(tài)變化較大、長得又快又好且透明圈明顯的突變株，通過表面張力檢測、排油圈和烴降解率等方法檢測正突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力，并挑選優(yōu)良突變株。

2.5.6 突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將挑選出的降解石油烴能力最強(qiáng)的突變株轉(zhuǎn)接至LB平板上，作為第1代，然后以相同方法連續(xù)繼代20代，每隔4代分別將其按照10%的比例接入原油發(fā)酵培養(yǎng)基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，測其降解率和表面張力，并將其與第1代菌株比較，確定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 石油烴降解菌的篩選與分離

從長慶油田石油污染土壤中分離得到可在油平板上生長且產(chǎn)生透明圈的石油烴降解菌6株，分別為CQ1、CQ2、CQ3、CQ4、CQ5和CQ6，經(jīng)過表面張力、排油圈和烴降解率等方法檢測，結(jié)果如表1所示：6株菌對石油烴的降解能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力有較為顯著的差異，菌株CQ6的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他菌株，且表面張力低于其他菌株。基于此，說明菌株CQ6的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng)，因此選取菌株CQ6進(jìn)行后續(xù)研究。

3.2 石油烴降解菌CQ6的表型特征和生理生化特性

將上述所選的石油烴高效降解菌株CQ6挑選出來并進(jìn)行顯微鏡鏡檢和菌落形態(tài)觀察。結(jié)果顯示：該菌個體形態(tài)為桿狀，G-，產(chǎn)橢圓形芽孢，芽孢囊膨大，菌落干燥、不透明且有皺褶，菌落邊緣有不規(guī)則擴(kuò)散。

對CQ6進(jìn)行生理生化檢測，結(jié)果顯示：CQ6為嚴(yán)格好氧菌，抗氯化鈉2%、5%、7%、10%，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，IMViC試驗(yàn)結(jié)果為-+++，淀粉水解和酪素水解試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

通過分析CQ6的表型特征和生理生化特征，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)和生理生化特點(diǎn)均和枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相同，據(jù)此，可初步判定菌株CQ6為芽孢桿菌屬。

3.3 CQ6的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育研究

菌株CQ6的16S rDNA片段（約1 500 bp）的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，將所得PCR產(chǎn)物測序，得到 1 492 bp 的序列，將該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的各近緣菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對，應(yīng)用Bioedit7.0軟件進(jìn)行多重比較，分析其同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），經(jīng)分析，所得序列和Bacillus pumilus（登錄號：X60637）顯示了99%的同源性，根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化特征，可確定菌株CQ6為短小芽孢桿菌。

3.4 突變株篩選

用激光照射誘變育種的生物學(xué)效應(yīng)主要是引起基因突變從而使酶激活或鈍化，激光照射時間會導(dǎo)致突變率發(fā)生變化，照射時間越長，突變率越高，但是致死率也隨之升高，因此要挑選合適的照射時間以保證一定的突變率和控制致死率。用激光對石油烴降解菌CQ6照射不同時間，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，隨著照射時間的延長，菌株的存活率不斷下降，正突變率的變化趨勢是先升高后降低，推斷造成這種情況的原因是由于照射時間過長，不僅會導(dǎo)致活菌數(shù)劇烈下

降，也會使更多的菌株出現(xiàn)負(fù)突變，因此，綜合考慮，CQ6的最佳照射時間選為15 min。

采用排油圈檢測、表面張力檢測和烴降解率等方法，5株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力均強(qiáng)于親本CQ6的菌株被挑選出來，分別編號為CQ61、CQ63、CQ65、CQ66和CQ67，其降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的結(jié)果如表3所示。

如表3所示，突變株CQ66的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他突變株，且表面張力低于其他突變株，說明該突變株的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力是突變株中最強(qiáng)的，故將其挑選出來，用于后續(xù)研究。

3.5 突變株遺傳穩(wěn)定性研究

把石油烴降解能力和產(chǎn)生表面活性劑能力均有所提高的突變株CQ66繼代培養(yǎng)20代，每隔4代的菌株分別做石油烴降解率和表面張力試驗(yàn)，結(jié)果（表4）表明各代降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力基本一致，說明突變株CQ66的降解石油烴能力的遺傳穩(wěn)定性良好。

4 討論

本研究從長慶油田石油污染的土壤中分離篩選得到一株高效降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的菌株CQ6，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

為了增強(qiáng)該菌株降解石油烴的能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力，對所選菌株進(jìn)行He-Ne激光誘變育種，并確定最佳照射時間為15 min。

He-Ne激光誘變后，采用排油圈檢測、表面張力檢測和烴降解率等方法挑選出降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng)的突變株CQ66，并對其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測， 試驗(yàn)結(jié)果表明，該突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的遺傳性狀穩(wěn)定，可用于制備固體菌劑或液體菌劑應(yīng)用于長慶油田石油污染土壤的生物修復(fù)。

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