王文成 林衍生 連建枝 張麗紅

摘要：以金線蓮組培苗根莖為研究材料，采用超聲波浸提法，選取超聲波功率、浸提時間、水提溫度為單因素水平，進行多糖、游離氨基酸提取工藝優(yōu)化研究。結(jié)果表明：在超聲波功率為89 W、浸提時間為68.5 min、水提溫度為79 ℃條件下，試驗測得多糖2.45 mg/mL，氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，綜合評價指標最高。

關(guān)鍵詞：金線蓮；多糖；游離氨基酸；響應(yīng)面法；提取工藝優(yōu)化

中圖分類號：TS275.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0287-04

金線蓮是我國南方名貴的草藥，有著“金草”“神藥”的美譽。近年來隨著組培技術(shù)的成熟，試管苗生產(chǎn)得以迅猛發(fā)展，目前組培產(chǎn)品已占市場份額的80%以上。盡管如此，由于其生長周期較長，金線蓮價格依舊居高不下。金線蓮采用組培方式生產(chǎn)中，試管苗葉片部分常被加工烘干成產(chǎn)品進行出售，根莖部分往往由于加工后成色不好，被大量丟棄，造成極大浪費。因而非常有必要開展金線蓮莖和根進行功能性物質(zhì)提取研究，以提高試管苗生產(chǎn)效益。目前金線蓮功能性物質(zhì)提取研究已有報道，但多是針對金線蓮本身進行單項功能物質(zhì)優(yōu)化提取等方面研究[1-7]，針對試管苗根、莖進行復(fù)合物質(zhì)提取鮮有報道。本研究從功能性大眾飲料生產(chǎn)角度，采用超聲波浸提法對金線蓮根莖部分浸提，以粗多糖、游離氨基酸含量作為評價指標，優(yōu)化前處理加工工藝，為今后綜合開發(fā)金線蓮功能性飲料提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為金線蓮組培苗的根、莖。葡萄糖、苯酚、硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、谷氨酸均為分析純。

1.2 試驗設(shè)備

紫外可見分光光度計UV-1800PC-DS2（上海美譜達儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； 真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；自動純水蒸餾器（上海嘉鵬科技有限公司）；九陽JYL-D055榨汁機（九陽股份有限公司）；KQ-100VDE臺式雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試液制備 取金線蓮組培苗根莖10 kg，清洗后陰涼處瀝水12 h，以每份100 g為1組，粉碎研磨后加水定容至1 500 mL，再進行超聲波輔助提取。在不同的超聲波功率、提取時間、提取溫度條件下，抽取金線蓮提取液后進行測定，測定重復(fù)3次，測量結(jié)果取平均值。

1.3.2 多糖測定 采用苯酚-硫酸法[8]進行葡萄糖測定。

葡萄糖標準曲線繪制：精確吸取0.10 mg/mL的葡萄糖工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于20 mL 具塞試管中，補水至1.00 mL；各加入5% 苯酚0.6 mL、濃硫酸6 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min；以 0號管為空白參比，于490 nm處測定吸光度，每濃度設(shè)重復(fù)測定3 次。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標，以吸光度D為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程D=6.437C-0.019（R2=0.991）。

1.3.3 游離氨基酸測定 參照GB/T 8314—2002《茶游離氨基酸總量測定》進行金線蓮游離氨基酸測定。

氨基酸標準曲線的制作：分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL氨基酸工作液于25 mL容量瓶中，各加水4 mL、pH值8.0的磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%的茚三酮溶液 0.5 mL，再沸水浴15 min，冷卻后加水定容至25 mL，測定吸光度（D）并繪制曲線，計算得回歸方程D=0.070C-0.021（R2=0.949）。

1.3.4 綜合指標 以多糖、游離氨基酸含量值為指標，運用隸屬度綜合評分法對金線蓮根莖水浸提工藝進行綜合評分。

l=Ci-CminCmax-Cmin。（1）

式中，Ci為指標值，Cmin為指標最小值，Cmax為指標最大值。

按式（2）進行加權(quán)得干燥工藝的綜合分S。

S=al1+bl2。（2）

式中，l1為指標1的隸屬度，l2為指標2的隸屬度，a為指標1的權(quán)值，b為指標2的權(quán)值。本研究以多糖提取得率為主要指標，游離氨基酸提取得率為次要指標，于是取 a=06，b=0.4?？紤]到檢測的差異性，以上指標的檢測重復(fù)3次，測量結(jié)果取平均值[9-10]。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 超聲波功率對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗條件固定為浸提溫度為65 ℃、浸提時間50 min，分別調(diào)節(jié)超聲波功率為60、70、80、90、100 W，過濾后測定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.4.2 浸提溫度對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗條件固定為超聲波功率90 W、浸提時間50 min，分別測試浸提溫度為60、65、70、75、80 ℃，過濾后測定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.4.3 浸提時間對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗條件固定為超聲波功率90 W、浸提溫度為75 ℃，分別測試浸提時間40、50、60、70、80 min，過濾后測定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取超聲波功率（x1）、浸提時間（x2）和水提溫度（x3）為試驗因素，以綜合評分為響應(yīng)值，進行3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化金線蓮根莖水提工藝條件。試驗因素和水平見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Design-Expert.V 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，多項式模型方程擬合的性質(zhì)由決定系數(shù)R2表達，統(tǒng)計學的顯著性用F值檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 超聲波功率對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖1可以看出，隨著超聲功率的升高，多糖和游離氨基酸的提取均呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，當超聲比功率為90 W時，二者的提取得率均達到最高值，而功率達100 W時，提取效率又略有降低。這是由于在超聲波產(chǎn)生的兩大效應(yīng)：空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)中，當超聲強度較小時，熱效應(yīng)可以忽略不計，此時超聲波功率越高，能量越大，產(chǎn)生的空化氣泡越大，細胞壁就被破壞得越完全，相應(yīng)的細胞內(nèi)多糖及游離氨基酸的提取得率增大；但隨著超聲強度的增加，產(chǎn)生的大量無用氣泡，增加了聲波散射衰減，空化效應(yīng)削弱，熱效應(yīng)此時起主要作用，這就可能造成細胞內(nèi)多糖及游離氨基酸的提取得率的降低[11-12]。綜合考慮，超聲波功率取90 W左右為宜。

2.1.2 水提溫度對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖2可以看出，在60～75 ℃范圍內(nèi)，隨著水提溫度的升高，多糖、游離氨基酸提取得率不斷升高，并于75 ℃時達到最高值，隨后微有下降；多糖在75 ℃過后下降的趨勢要比游離氨基酸明顯。說明水提溫度過高可能導致多糖降解，從而引起提取得率下降，所以浸提溫度不宜過高，而游離氨基酸則相對耐受溫度要高一些。綜合考慮取浸提溫度75 ℃左右為宜。

2.1.3 浸提時間對多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖3可以看出，在浸提時間為40～60 min范圍內(nèi)，隨著浸提時間的延長，多糖、游離氨基酸提取得率隨著時間的延長而增加。60 min以后，多糖、游離氨基酸先后出現(xiàn)提取得率降低的趨勢。這是由于在60 min之前，由于時間較短，多糖、游離氨基酸溶解不充分，故浸提時間與浸提得率呈正相關(guān)，而在 60 min 之后，多糖、游離氨基酸在75 ℃溫度下長時間浸提出現(xiàn)部分降解，該趨勢隨著時間的推移對提取得率的負面效應(yīng)要大于正面效應(yīng)，因而提取得率不再隨浸提時間的延長而顯著增加。此外，亦有文獻指出長時間的超聲波萃取會對提取效果產(chǎn)生不利的影響[12]。單從各指標的提取得率上看，多糖較好的提取時間是在60 min左右，而游離氨基酸則為 70 min 左右?？紤]到本試驗中多糖的權(quán)值要大于游離氨基酸。因此，綜合考慮浸提時間設(shè)在60 min左右為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定超聲波功率90 W、浸提時間60 min、水提溫度75 ℃等參數(shù)，對金線蓮根莖水提工藝進行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2.1 試驗結(jié)果數(shù)據(jù) 響應(yīng)曲面試驗方案及試驗結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 利用Design-Expert.V 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得回歸方程：

S=0.82+0.11x1+0.095x2+0.16x3-0.24x1x2-0.10x1x3+0.11x2x3-0.24x12-0.097x22-0.11x32。

其中S為金線蓮根莖水提工藝綜合評分響應(yīng)值，x1、x2、x3 為超聲波功率、浸提時間、水提溫度編碼值。

由方差分析結(jié)果（表3）可知，模型項P值等于0.001，表明該模型高度顯著，失擬度0.853>0.01，說明該模型可信度高，試驗數(shù)據(jù)與模型不相符合的情況不顯著，而且調(diào)整確定系數(shù)與預(yù)測確定系數(shù)之差（Adj-R2-Pre-R2）<0.2，說明模型的試驗值與預(yù)測值相關(guān)性較高，模型準確[11，1]。回歸方程的R2=0.943 7與校正R2=0.871 4相近，表明金線蓮根莖水提工藝綜合評分試驗值和預(yù)測值有較好的擬合度，可用于試驗結(jié)果的預(yù)測[13-16]。從數(shù)據(jù)上看x3、x1x2對金線蓮根莖水提工藝綜合評分曲面效應(yīng)影響極其顯著，x1、x2影響顯著，而x2x3、x1x3影響不顯著，影響金線蓮根莖水提工藝的3個影響因素的主次順序為x3>x1>x2，即水提溫度>超聲波功率>浸提時間。

圖4直觀地反映了當水提溫度固定時，超聲波功率和浸提時間的交互作用。在選定的條件范圍內(nèi)，響應(yīng)面等高線相對較為密集，坡度較為陡峭，表明響應(yīng)值（金線蓮根莖水提工藝綜合評分）對超聲波功率和浸提時間交互作用的改變較為敏感，金線蓮根莖水提工藝綜合評分較高值落在兩坐標編碼值的中間偏上區(qū)域。隨著超聲波功率的變大或變小，和浸提時間的變長或變短，金線蓮根莖水提工藝綜合評分值都下降。

2.2.3 水提工藝參數(shù)優(yōu)化 以綜合評分為響應(yīng)值，利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進行最優(yōu)化分析，得到當x1=-0.11，x2=0.85，x3=0.70，即超聲波功率為88.9 W，浸提時間為68.5 min，水提溫度為78.5 ℃時，綜合評分最高，達0.961。考慮到實際操作的方便，取超聲波功率為89 W、浸提時間為68.5 min、水提溫度為79 ℃時，進行驗證性試驗測得多糖2.45 mg/mL，游離氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，試驗值與預(yù)測值接近，驗證了該模型的可靠性。

3 結(jié)論

在本試驗中根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計理論得出：在設(shè)定考察的3個因素及考量的區(qū)域中水提溫度對產(chǎn)品的綜合提取效果影響最大，超聲波功率次之，浸提時間最小。

建立了金線蓮根莖水提工藝的綜合分與水提溫度、超聲波功率、浸提時間的二次多項式回歸模型，得到最佳工藝參數(shù)。經(jīng)試驗驗證，超聲波功率為89 W、浸提時間為 68.5 min、水提溫度為79 ℃時，驗證性試驗測得多糖 2.45 mg/mL，游離氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，相對誤差為 0.93%。試驗值與理論值是吻合的，證明了該模型的合理可靠性。

響應(yīng)面法直觀地分析了因素交互項的影響，得出了超聲波功率和浸提時間的交互作用對綜合分指標影響顯著，而其他因素交互作用不顯著。

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