王文成 林衍生 連建枝 張麗紅

摘要：以金線蓮組培苗根莖為研究材料，采用超聲波浸提法，選取超聲波功率、浸提時(shí)間、水提溫度為單因素水平，進(jìn)行多糖、游離氨基酸提取工藝優(yōu)化研究。結(jié)果表明：在超聲波功率為89 W、浸提時(shí)間為68.5 min、水提溫度為79 ℃條件下，試驗(yàn)測(cè)得多糖2.45 mg/mL，氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)最高。

關(guān)鍵詞：金線蓮；多糖；游離氨基酸；響應(yīng)面法；提取工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS275.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0287-04

金線蓮是我國(guó)南方名貴的草藥，有著“金草”“神藥”的美譽(yù)。近年來(lái)隨著組培技術(shù)的成熟，試管苗生產(chǎn)得以迅猛發(fā)展，目前組培產(chǎn)品已占市場(chǎng)份額的80%以上。盡管如此，由于其生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，金線蓮價(jià)格依舊居高不下。金線蓮采用組培方式生產(chǎn)中，試管苗葉片部分常被加工烘干成產(chǎn)品進(jìn)行出售，根莖部分往往由于加工后成色不好，被大量丟棄，造成極大浪費(fèi)。因而非常有必要開(kāi)展金線蓮莖和根進(jìn)行功能性物質(zhì)提取研究，以提高試管苗生產(chǎn)效益。目前金線蓮功能性物質(zhì)提取研究已有報(bào)道，但多是針對(duì)金線蓮本身進(jìn)行單項(xiàng)功能物質(zhì)優(yōu)化提取等方面研究[1-7]，針對(duì)試管苗根、莖進(jìn)行復(fù)合物質(zhì)提取鮮有報(bào)道。本研究從功能性大眾飲料生產(chǎn)角度，采用超聲波浸提法對(duì)金線蓮根莖部分浸提，以粗多糖、游離氨基酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化前處理加工工藝，為今后綜合開(kāi)發(fā)金線蓮功能性飲料提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為金線蓮組培苗的根、莖。葡萄糖、苯酚、硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、谷氨酸均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1800PC-DS2（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； 真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；自動(dòng)純水蒸餾器（上海嘉鵬科技有限公司）；九陽(yáng)JYL-D055榨汁機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）；KQ-100VDE臺(tái)式雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試液制備 取金線蓮組培苗根莖10 kg，清洗后陰涼處瀝水12 h，以每份100 g為1組，粉碎研磨后加水定容至1 500 mL，再進(jìn)行超聲波輔助提取。在不同的超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度條件下，抽取金線蓮提取液后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定重復(fù)3次，測(cè)量結(jié)果取平均值。

1.3.2 多糖測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[8]進(jìn)行葡萄糖測(cè)定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確吸取0.10 mg/mL的葡萄糖工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于20 mL 具塞試管中，補(bǔ)水至1.00 mL；各加入5% 苯酚0.6 mL、濃硫酸6 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min；以 0號(hào)管為空白參比，于490 nm處測(cè)定吸光度，每濃度設(shè)重復(fù)測(cè)定3 次。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度D為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程D=6.437C-0.019（R2=0.991）。

1.3.3 游離氨基酸測(cè)定 參照GB/T 8314—2002《茶游離氨基酸總量測(cè)定》進(jìn)行金線蓮游離氨基酸測(cè)定。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL氨基酸工作液于25 mL容量瓶中，各加水4 mL、pH值8.0的磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%的茚三酮溶液 0.5 mL，再沸水浴15 min，冷卻后加水定容至25 mL，測(cè)定吸光度（D）并繪制曲線，計(jì)算得回歸方程D=0.070C-0.021（R2=0.949）。

1.3.4 綜合指標(biāo) 以多糖、游離氨基酸含量值為指標(biāo)，運(yùn)用隸屬度綜合評(píng)分法對(duì)金線蓮根莖水浸提工藝進(jìn)行綜合評(píng)分。

l=Ci-CminCmax-Cmin。（1）

式中，Ci為指標(biāo)值，Cmin為指標(biāo)最小值，Cmax為指標(biāo)最大值。

按式（2）進(jìn)行加權(quán)得干燥工藝的綜合分S。

S=al1+bl2。（2）

式中，l1為指標(biāo)1的隸屬度，l2為指標(biāo)2的隸屬度，a為指標(biāo)1的權(quán)值，b為指標(biāo)2的權(quán)值。本研究以多糖提取得率為主要指標(biāo)，游離氨基酸提取得率為次要指標(biāo)，于是取 a=06，b=0.4?？紤]到檢測(cè)的差異性，以上指標(biāo)的檢測(cè)重復(fù)3次，測(cè)量結(jié)果取平均值[9-10]。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 超聲波功率對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗(yàn)條件固定為浸提溫度為65 ℃、浸提時(shí)間50 min，分別調(diào)節(jié)超聲波功率為60、70、80、90、100 W，過(guò)濾后測(cè)定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.4.2 浸提溫度對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗(yàn)條件固定為超聲波功率90 W、浸提時(shí)間50 min，分別測(cè)試浸提溫度為60、65、70、75、80 ℃，過(guò)濾后測(cè)定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.4.3 浸提時(shí)間對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 將試驗(yàn)條件固定為超聲波功率90 W、浸提溫度為75 ℃，分別測(cè)試浸提時(shí)間40、50、60、70、80 min，過(guò)濾后測(cè)定提取液中多糖和游離氨基酸的含量。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取超聲波功率（x1）、浸提時(shí)間（x2）和水提溫度（x3）為試驗(yàn)因素，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化金線蓮根莖水提工藝條件。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Design-Expert.V 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，多項(xiàng)式模型方程擬合的性質(zhì)由決定系數(shù)R2表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性用F值檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 超聲波功率對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖1可以看出，隨著超聲功率的升高，多糖和游離氨基酸的提取均呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)超聲比功率為90 W時(shí)，二者的提取得率均達(dá)到最高值，而功率達(dá)100 W時(shí)，提取效率又略有降低。這是由于在超聲波產(chǎn)生的兩大效應(yīng)：空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)中，當(dāng)超聲強(qiáng)度較小時(shí)，熱效應(yīng)可以忽略不計(jì)，此時(shí)超聲波功率越高，能量越大，產(chǎn)生的空化氣泡越大，細(xì)胞壁就被破壞得越完全，相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)多糖及游離氨基酸的提取得率增大；但隨著超聲強(qiáng)度的增加，產(chǎn)生的大量無(wú)用氣泡，增加了聲波散射衰減，空化效應(yīng)削弱，熱效應(yīng)此時(shí)起主要作用，這就可能造成細(xì)胞內(nèi)多糖及游離氨基酸的提取得率的降低[11-12]。綜合考慮，超聲波功率取90 W左右為宜。

2.1.2 水提溫度對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖2可以看出，在60～75 ℃范圍內(nèi)，隨著水提溫度的升高，多糖、游離氨基酸提取得率不斷升高，并于75 ℃時(shí)達(dá)到最高值，隨后微有下降；多糖在75 ℃過(guò)后下降的趨勢(shì)要比游離氨基酸明顯。說(shuō)明水提溫度過(guò)高可能導(dǎo)致多糖降解，從而引起提取得率下降，所以浸提溫度不宜過(guò)高，而游離氨基酸則相對(duì)耐受溫度要高一些。綜合考慮取浸提溫度75 ℃左右為宜。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)多糖和游離氨基酸含量的浸提影響 從圖3可以看出，在浸提時(shí)間為40～60 min范圍內(nèi)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖、游離氨基酸提取得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。60 min以后，多糖、游離氨基酸先后出現(xiàn)提取得率降低的趨勢(shì)。這是由于在60 min之前，由于時(shí)間較短，多糖、游離氨基酸溶解不充分，故浸提時(shí)間與浸提得率呈正相關(guān)，而在 60 min 之后，多糖、游離氨基酸在75 ℃溫度下長(zhǎng)時(shí)間浸提出現(xiàn)部分降解，該趨勢(shì)隨著時(shí)間的推移對(duì)提取得率的負(fù)面效應(yīng)要大于正面效應(yīng)，因而提取得率不再隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。此外，亦有文獻(xiàn)指出長(zhǎng)時(shí)間的超聲波萃取會(huì)對(duì)提取效果產(chǎn)生不利的影響[12]。單從各指標(biāo)的提取得率上看，多糖較好的提取時(shí)間是在60 min左右，而游離氨基酸則為 70 min 左右?？紤]到本試驗(yàn)中多糖的權(quán)值要大于游離氨基酸。因此，綜合考慮浸提時(shí)間設(shè)在60 min左右為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定超聲波功率90 W、浸提時(shí)間60 min、水提溫度75 ℃等參數(shù)，對(duì)金線蓮根莖水提工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù) 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 利用Design-Expert.V 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：

S=0.82+0.11x1+0.095x2+0.16x3-0.24x1x2-0.10x1x3+0.11x2x3-0.24x12-0.097x22-0.11x32。

其中S為金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分響應(yīng)值，x1、x2、x3 為超聲波功率、浸提時(shí)間、水提溫度編碼值。

由方差分析結(jié)果（表3）可知，模型項(xiàng)P值等于0.001，表明該模型高度顯著，失擬度0.853>0.01，說(shuō)明該模型可信度高，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符合的情況不顯著，而且調(diào)整確定系數(shù)與預(yù)測(cè)確定系數(shù)之差（Adj-R2-Pre-R2）<0.2，說(shuō)明模型的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相關(guān)性較高，模型準(zhǔn)確[11，1]?；貧w方程的R2=0.943 7與校正R2=0.871 4相近，表明金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值有較好的擬合度，可用于試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)[13-16]。從數(shù)據(jù)上看x3、x1x2對(duì)金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分曲面效應(yīng)影響極其顯著，x1、x2影響顯著，而x2x3、x1x3影響不顯著，影響金線蓮根莖水提工藝的3個(gè)影響因素的主次順序?yàn)閤3>x1>x2，即水提溫度>超聲波功率>浸提時(shí)間。

圖4直觀地反映了當(dāng)水提溫度固定時(shí)，超聲波功率和浸提時(shí)間的交互作用。在選定的條件范圍內(nèi)，響應(yīng)面等高線相對(duì)較為密集，坡度較為陡峭，表明響應(yīng)值（金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分）對(duì)超聲波功率和浸提時(shí)間交互作用的改變較為敏感，金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分較高值落在兩坐標(biāo)編碼值的中間偏上區(qū)域。隨著超聲波功率的變大或變小，和浸提時(shí)間的變長(zhǎng)或變短，金線蓮根莖水提工藝綜合評(píng)分值都下降。

2.2.3 水提工藝參數(shù)優(yōu)化 以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，利用軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最優(yōu)化分析，得到當(dāng)x1=-0.11，x2=0.85，x3=0.70，即超聲波功率為88.9 W，浸提時(shí)間為68.5 min，水提溫度為78.5 ℃時(shí)，綜合評(píng)分最高，達(dá)0.961?？紤]到實(shí)際操作的方便，取超聲波功率為89 W、浸提時(shí)間為68.5 min、水提溫度為79 ℃時(shí)，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)測(cè)得多糖2.45 mg/mL，游離氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了該模型的可靠性。

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)中根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)理論得出：在設(shè)定考察的3個(gè)因素及考量的區(qū)域中水提溫度對(duì)產(chǎn)品的綜合提取效果影響最大，超聲波功率次之，浸提時(shí)間最小。

建立了金線蓮根莖水提工藝的綜合分與水提溫度、超聲波功率、浸提時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸模型，得到最佳工藝參數(shù)。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，超聲波功率為89 W、浸提時(shí)間為 68.5 min、水提溫度為79 ℃時(shí)，驗(yàn)證性試驗(yàn)測(cè)得多糖 2.45 mg/mL，游離氨基酸0.61 mg/mL，綜合分值0.952，相對(duì)誤差為 0.93%。試驗(yàn)值與理論值是吻合的，證明了該模型的合理可靠性。

響應(yīng)面法直觀地分析了因素交互項(xiàng)的影響，得出了超聲波功率和浸提時(shí)間的交互作用對(duì)綜合分指標(biāo)影響顯著，而其他因素交互作用不顯著。

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