朱明，王彩霞，李春,

(1 天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081 )

引 言

三萜類化合物是一類由多個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成的含有30 個(gè)碳原子的烴類含氧衍生物。結(jié)構(gòu)上多為四環(huán)三萜或五環(huán)三萜。其中代表性的有甘草次酸（Glycyrrhetinic acid）、人參皂苷（Ginsenosides）、白樺脂酸（betulinic acid）、烏蘇酸（ursolic acid）等。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，人參皂苷又分為齊墩果酸型（oleanolic acid）、人參二醇型（protopanaxadiol）、人參三醇型（protopanaxatriol），具體結(jié)構(gòu)式如圖1所示。藥理學(xué)證明三萜類化合物具有多樣化的藥理活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健領(lǐng)域。人參皂苷具有較好的抗腫瘤、抗炎癥等功效，是名貴中藥材人參與西洋參的主要成分[1]；甘草酸在保肝[2]、抗病毒[3]、抗過(guò)敏[4]、抗癌癥[5]等方面具有非常重要的作用，同時(shí)也可作為甜味劑或者食用添加劑[6]。甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）作為甘草酸生物合成的前體物質(zhì)，具有相似的醫(yī)藥價(jià)值，并且極性較弱，容易透過(guò)細(xì)胞膜，藥物動(dòng)力學(xué)證明甘草酸的功能主要通過(guò)甘草次酸的形式實(shí)現(xiàn)，它是甘草酸發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)[7]；研究證明大豆皂苷同樣具有抗腫瘤[8]、降低膽固醇[9]等保健作用。

目前三萜類化合物的合成主要是通過(guò)植物提取，以甘草次酸為例，將植物甘草中提取的甘草酸，加工為銨鹽后再經(jīng)水解得到甘草次酸。歷經(jīng)粉碎、過(guò)濾、蒸發(fā)、濃縮、攪拌、水洗、重結(jié)晶、脫色等多個(gè)步驟，提取效率低，并且周期長(zhǎng)、成本高、對(duì)環(huán)境破壞較大，僅靠甘草、大豆、人參、柴胡等藥用植物的天然生產(chǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足化工、藥物等多個(gè)領(lǐng)域?qū)θ祁惢衔锏男枨?，如何快速高效可持續(xù)地生產(chǎn)是人們遇到的難題。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物來(lái)生產(chǎn)萜類等具有重大醫(yī)藥價(jià)值的化合物得到了越來(lái)越多的關(guān)注。在代謝途徑層面上，利用合成生物學(xué)技術(shù)可以對(duì)現(xiàn)有的生物合成路徑在微生物細(xì)胞工廠中進(jìn)行重建，或者針對(duì)不同宿主，對(duì)整個(gè)代謝途徑進(jìn)行重新設(shè)計(jì)與構(gòu)建，將基因線路等小零件組裝到微生物細(xì)胞工廠中，從而生產(chǎn)特定的目標(biāo)產(chǎn)物。許多的燃料化學(xué)品正是基于此而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠化的生產(chǎn)，如醇類、脂肪酸酯、烴類物質(zhì)[10]。Liao 等改造大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇[11]與正丁醇[12]；Zhang 等[13]利用大腸桿菌組成型生產(chǎn)異丁醇；Keasling 等[14]利用大腸桿菌構(gòu)建了脂肪酸酯的合成路徑，生物柴油的產(chǎn)率達(dá)到了理論值的9.4%。目前在釀酒酵母內(nèi)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)三萜類化合物骨架（如2,3-氧化鯊烯、β-香樹脂醇）的合成，那么如何高效地對(duì)三萜骨架進(jìn)行特異性氧化是人們遇到的又一難題。

本文將對(duì)釀酒酵母中三萜類化合物的合成途徑及在此途徑中起關(guān)鍵作用的CYP450 氧化酶進(jìn)行介紹。

1 三萜類化合物合成途徑的解析

自然界中存在兩種萜類合成途徑（圖1）：甲羥戊酸途徑（MVA）與1-脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（MEP），兩個(gè)途徑均能合成異戊烯基焦磷酸（IPP）與二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步反應(yīng)生成香葉基焦磷酸（GPP），法呢基焦磷酸（FPP）。其中GPP 為單萜的合成骨架，F(xiàn)PP 為倍半萜的合成骨架。由 FPP 與 IPP 反應(yīng)生成的GGPP(香葉基香葉基焦磷酸)為二萜的合成骨架。

MEP 途徑為大腸桿菌唯一的萜類合成途徑，但是該途徑?jīng)]有GGPP 合成能力，而且很少能表達(dá)有活性的植物來(lái)源的CYP450 氧化酶，因此大腸桿菌不適于三萜類物質(zhì)的生產(chǎn)。相比之下，酵母具有普遍存在于真核生物細(xì)胞的MVA 途徑，且自身具有類異戊二烯與固醇的合成途徑，并且在結(jié)構(gòu)上還具有完整的膜系統(tǒng)，非常適合表達(dá)有活性的植物來(lái)源的CYP450 氧化酶。所以目前三萜化合物的人工合成主要是在酵母細(xì)胞內(nèi)完成的。

MVA 途徑所產(chǎn)生的化合物是許多藥物中間體與化工原料的重要來(lái)源，應(yīng)用十分廣泛。目前許多研究就是針對(duì)酵母內(nèi)MVA 途徑進(jìn)行改造從而生產(chǎn)目的產(chǎn)物。具有重要醫(yī)藥價(jià)值的抗瘧疾藥物——倍半萜類青蒿素的生物合成就是最成功的例子。Keasling 等選擇釀酒酵母作為宿主，過(guò)量表達(dá)HMG輔酶A 還原酶，替換鯊烯合成酶啟動(dòng)子降低其表達(dá)量，使法呢基焦磷酸的產(chǎn)量得到積累，同時(shí)引入來(lái)源青蒿的紫穗槐-4,11-二烯合成酶、細(xì)胞色素CYP450 單氧化酶和NADPH-細(xì)胞色素CYP450 氧化還原酶，使釀酒酵母可以直接合成青蒿酸[20]。在此基礎(chǔ)上，在釀酒酵母中引入2 種脫氫酶：乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶，可以將青蒿酸生物合成中由單一的細(xì)胞色素氧化酶 CYP71AV1 催化的由amorphadiene 到青蒿酸的3 步反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)橛啥鄠€(gè)酶（CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、ALDH1）催化的3 步反應(yīng)，大大提高反應(yīng)效率，從而在酵母中重建了青蒿酸的生物合成途徑，最終經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化，青蒿酸產(chǎn)量達(dá)到25 g·L-1[21]。抗癌藥物二萜類的紫杉醇在生物合成方面的研究也取得了很大的進(jìn)展：Stephanopoulos 等[22]將紫杉二烯的合成途徑引入大腸桿菌中，并對(duì)整個(gè)代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化，獲得高產(chǎn)紫杉二烯的大腸桿菌細(xì)胞，產(chǎn)量達(dá)到了1 g·L-1。

但是關(guān)于三萜類化合物完整的生物合成路徑尚不清晰。以甘草次酸為例，直到2008年，日本的Muranaka 等[17]通過(guò)ESTs (表達(dá)序列標(biāo)簽)結(jié)合轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素單氧化酶基因CYP88D6，通過(guò)體外與酵母體內(nèi)的酶活檢測(cè)，最終確定了此基因編碼的酶可以順序催化β-香樹脂醇11 位上的C 首先羥基化，然后進(jìn)一步氧化為11-oxo-β-amyrin[17]。在此基礎(chǔ)上，2011年該課題組又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)酶CYP72A154，該酶具有氧化11-oxo-β-amyrin 的能力， 通過(guò)三步順序氧化， 兩個(gè)中間產(chǎn)物（30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin、glycyrrhetaldehyde），實(shí)現(xiàn)了由11-oxo-β-amyrin 到甘草次酸的轉(zhuǎn)化[16]。通過(guò)這兩種細(xì)胞色素氧化酶的催化功能，實(shí)現(xiàn)了由β-

香樹脂醇到甘草次酸的轉(zhuǎn)化，目前已報(bào)道酵母內(nèi)甘草次酸產(chǎn)量約為15 μg·L-1。其可能的催化過(guò)程如圖2 所示。但是兩個(gè)氧化酶催化效率比較低，因此還需繼續(xù)尋找催化效率更高的酶或?qū)σ延械难趸高M(jìn)行人工改造提高催化效率，從而最終提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量。

圖1 三萜類化合物的生物合成路徑[15-19]Fig.1 Biosynthesis pathway for triterpeneoids[15-19]

圖2 甘草次酸的生物合成路徑[16-17]Fig.2 Biosynthesis pathway for glycyrrhetinic acid[16-17]

在三萜類化合物整個(gè)合成途徑的前體物中，β-香樹脂醇的研究最引人注目。鯊烯合酶催化兩個(gè)FPP 發(fā)生縮合反應(yīng)生成鯊烯，其在環(huán)化酶的催化下生成2,3-氧化鯊烯，β-香樹脂醇合成酶則催化2,3-氧化鯊烯形成齊墩果烷型五環(huán)三萜的骨架β-香樹脂醇。但是由于酵母本身缺少以上3 種酶，無(wú)法合成β-香樹脂醇。迄今為止，已經(jīng)從擬南芥、豌豆、紫苑等多種植物中克隆到β-香樹脂醇合成酶基因。Zhang 等[15]的研究表明在釀酒酵母中提高限速酶的表達(dá)量，增加前提物供應(yīng)，可以增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，β-香樹脂醇產(chǎn)量達(dá)到了107 mg·L-1。Li 等利用合成生物學(xué)手段，通過(guò)染色體重組整合技術(shù)，對(duì)β-香樹脂醇合成路徑進(jìn)行了精細(xì)的調(diào)控，構(gòu)建出了組成型穩(wěn)定生產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母工程菌，發(fā)酵優(yōu)化后產(chǎn)量達(dá)到156.7 mg·L-1（data not published），為以β-香樹脂醇為前體物的其他萜類物質(zhì)的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

2 三萜類合成途徑在釀酒酵母中的組裝

釀酒酵母是單細(xì)胞，能進(jìn)行高密度發(fā)酵，遺傳背景清楚，具有良好的生物安全性，并且針對(duì)其遺傳改造的方法成熟多樣，因此釀酒酵母被認(rèn)為是合成天然產(chǎn)物的理想宿主。細(xì)胞內(nèi)三萜化合物合成途徑中各關(guān)鍵酶基因正確高效地導(dǎo)入到釀酒酵母中是至關(guān)重要的一步。利用釀酒酵母本身具有的同源重組功能可以實(shí)現(xiàn)高GC 含量、多片段、大片段（454 kb）在細(xì)胞中的精確組裝[23]。Zhang 等[15]利用DNA assembler 方法成功地將三萜合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因片段同時(shí)導(dǎo)入到釀酒酵母中，增加了前體物供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了人參二醇型（protopanaxadiol）、人參三醇型（protopanaxatriol）人參皂苷的合成。在多途徑組裝方面，Wingler 等[24]利用迭代拼接法將多基因線路直接組裝到酵母染色體中，運(yùn)用此方法構(gòu)建的模擬文庫(kù)可以包含104生物合成途徑。在途徑優(yōu)化方面模塊化的平衡理論有著非常重要的作用。Stephanopoulos 等[22]將紫杉醇合成路徑分為上游前體物供應(yīng)模塊與下游合成模塊，分別對(duì)它們進(jìn)行構(gòu)建與優(yōu)化，從而大幅度提高了紫杉二烯的產(chǎn)量。大規(guī)?；蚪M編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9 系統(tǒng)）的飛快發(fā)展也為酵母體內(nèi)的多個(gè)靶基因的同時(shí)編輯提供了可能。如Keasling 等[25]利用此技術(shù)對(duì)甲羥戊酸途徑中的5 個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行敲除，使甲羥戊酸產(chǎn)量提高了41 倍。

3 三萜類合成途徑中細(xì)胞色素氧化酶的挖掘與應(yīng)用

CYP450 氧化酶是一類超基因家族編碼的含有血紅素的氧化酶類，廣泛分布于植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌，具有多樣化的催化功能，參與萜類、生物堿類、甾醇類及其他一些物質(zhì)的合成與代謝反應(yīng)，主要催化的反應(yīng)有羥基化、環(huán)氧化、脫羥基化等。自從第一個(gè)植物CYP450 氧化酶CYP71A1 在酵母體內(nèi)成功表達(dá)之后[26]，越來(lái)越多的植物來(lái)源的CYP450 氧化酶在酵母體內(nèi)進(jìn)行了功能驗(yàn)證。如大豆的苯基脲類羥化酶/N-去甲基酶CYP71A10[27]、3,9-二氫紫檀-α-羥化酶CYP93A1[28]、黃酮合酶CYP93B6[29]；擬南芥中的反式肉桂酸-4-羥化酶CYP73A5[30]、阿魏酸-5-羥化酶CYP84A1[31]、對(duì)香豆酰-3-羥化酶CYP98A3[32]，還有紅豆杉中的紫杉烷-10β-羥化酶CYP725A1[33]等。

以β-香樹脂醇為前體物合成甘草次酸等三萜類化合物的過(guò)程中，細(xì)胞色素氧化酶起著決定性的作用。β-香樹脂醇不僅經(jīng)CYP450 氧化酶催化可以生成甘草次酸，也可在其他CYP450 氧化酶的作用下，生成三萜皂苷類物質(zhì)。在蘭賽蘭特杜莖山內(nèi)，β-香樹脂醇經(jīng)CYP716A15 與CYP87D16 的共同催化，生成十六-羥基齊墩果酸[34]。在苜蓿內(nèi)，β-香樹脂醇可被CYP93E2 與CYP72A61v2 催化生成大豆皂醇B（soyasapogenol B），或者被 CYP716A12 與CYP72A68v2 催化形成絲石竹酸（gypsogenic acid）[19,35]。在柴胡內(nèi)，CYP716Y1 與CYP716A12共同催化 β-香樹脂醇生成刺囊酸（echinocystic acid）[36]。

那么如何對(duì)起關(guān)鍵作用的CYP450 酶進(jìn)行挖掘呢？截至2013年12月，植物中已經(jīng)注釋過(guò)的細(xì)胞色素氧化酶已經(jīng)超到7512 個(gè)[37]，未來(lái)越來(lái)越多的酶將被發(fā)現(xiàn)與注釋。目前對(duì)CYP450 氧化酶的挖掘主要利用轉(zhuǎn)錄組分析的手段。2014年Chen 等[38]對(duì)秤星樹的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，按照三萜皂苷的結(jié)構(gòu)推斷出可能的合成路徑，并且結(jié)合進(jìn)化分析，從數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找可能起催化作用的CYP450 氧化酶。Ghosh等[39]通過(guò)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)植物羅勒中次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，最終發(fā)現(xiàn)了388 個(gè)響應(yīng)茉莉酸甲酯的轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步結(jié)合代謝分析，發(fā)現(xiàn)了編碼α/β-香樹脂醇合成酶的基因。Chen 等[40]利用甘草的EST 數(shù)據(jù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)參與甘草酸合成途徑中的16 個(gè)酶的編碼基因。Dixon 等[41]對(duì)基因表達(dá)簇的綜合分析，挖掘催化苜蓿中萜類物質(zhì)合成的酶。2013年Ramilowski 等[42]對(duì)甘草的轉(zhuǎn)錄組（不同產(chǎn)量、組織、季節(jié)等）分析發(fā)現(xiàn)43882 個(gè)unigene，并對(duì)可能參與其中的CYP450 氧化酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶等進(jìn)行了注釋。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步深入解析甘草次酸合成途徑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

但是植物體內(nèi)三萜及其他萜類的合成路徑的解析，不能簡(jiǎn)單地通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析得到。2011年Goossens 等[43]對(duì)苜蓿的毛狀根通過(guò)反相高效液相色譜-負(fù)離子電噴霧離子化與傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜[reversedphase liquid chromatography coupled to negative-ion electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC ESI FT-ICR MS)]聯(lián)用的方式，成功檢測(cè)到未知化合物并對(duì)其進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)分析，在檢測(cè)到的79 種皂苷中，61 種是新發(fā)現(xiàn)的。這一技術(shù)的開發(fā)與研究結(jié)果將有助于三萜皂苷合成過(guò)程中功能基因組學(xué)的研究。

在酵母體內(nèi)CYP450 氧化酶催化的反應(yīng)中必須有CYP450 氧化酶還原酶（CPR）的參與。CPR 是一種膜錨定蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它擁有3 個(gè)輔因子結(jié)合域（FMN、FAD、NADPH），其中的一個(gè)linker 位于FMN 與FAD/NADPH 之間。CPR 在功能上主要是將NADPH 傳遞來(lái)的電子傳遞到CYP450 氧化酶的血紅素上[37,44]。酵母內(nèi)源的CPR表達(dá)量低，并不能有效地傳遞電子，造成電子傳遞效率的不匹配，影響了CYP450 氧化酶最大活力的表達(dá)。植物來(lái)源的CPR 的表達(dá)是酵母體內(nèi)CYP450 氧化酶高效表達(dá)的關(guān)鍵。在CPR 的篩選研究中，CPR 大多來(lái)自植物本身，如AtCPR1[15]、LjCPR1[17]等。

目前提高CYP450 氧化酶的活力主要是通過(guò)對(duì)酶分子進(jìn)行人工改造或適應(yīng)性進(jìn)化。2014年Nielsen等[45]對(duì)釀酒酵母進(jìn)行了耐熱的適應(yīng)性進(jìn)化研究，發(fā)現(xiàn)改變甾醇的類型可以明顯提高酵母的耐熱性，從而為研究酵母的耐熱性奠定了基礎(chǔ)；在植物中，CYP450 氧化酶的表達(dá)量明顯高于CPR，因?yàn)檫^(guò)量表達(dá)CPR 對(duì)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生毒害作用：電子傳遞不匹配，產(chǎn)生化學(xué)活性氧自由基。在一些微生物體內(nèi)可以通過(guò)建立CYP450-CPR 融合蛋白表達(dá)的方式來(lái)減少對(duì)CPR 細(xì)胞的毒害，如融合了紅豆杉CPR 的CYP725A4 氧化酶在大腸桿菌宿主表達(dá)后顯示了其催化活性[22]。

4 釀酒酵母合成三萜類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與過(guò)程強(qiáng)化

三萜物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成后很少能分泌到胞外，有些物質(zhì)的累積對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)對(duì)整個(gè)合成路徑產(chǎn)生反饋抑制，影響代謝流方向，打破了整個(gè)代謝通路的平衡。如果能將代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞，不僅減少對(duì)細(xì)胞的傷害，有利于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，而且能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前已報(bào)道運(yùn)輸三萜物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非常少，植物內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)PDR 蛋白參與萜類物質(zhì)代謝運(yùn)輸。在煙草中，NpPDR1 蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)二萜香紫蘇醇[46]。

Goossens 等發(fā)現(xiàn)添加β-環(huán)糊精（β-CD）類物質(zhì)可以將異源非揮發(fā)性疏水三萜類物質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。β-CD 是多個(gè)吡喃葡萄糖單元以α-1,4 鍵結(jié)合生成的環(huán)狀物質(zhì)，具有桶裝的外形與內(nèi)腔，在整個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，外側(cè)具有多個(gè)羥基，呈親水性；內(nèi)部由氫原子與氧原子構(gòu)成，具有疏水性，整個(gè)空腔可以包裹萜類化合物。由于其中的葡萄糖單體具有5 個(gè)手性中心，所以它常作為手性固定相分離光學(xué)異構(gòu)體，在氣相色譜中應(yīng)用比較廣泛。研究結(jié)果表明，添加甲基β-環(huán)糊精可促進(jìn)β-香樹脂醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，明顯減少產(chǎn)物的反饋抑制，提高產(chǎn)率。環(huán)糊精結(jié)構(gòu)不同，效果差異巨大：甲基β-環(huán)糊精（MβCD）效果最好，β-環(huán)糊精次之，并且作用效果呈劑量效應(yīng)，α-環(huán)糊精與γ-環(huán)糊精則不具有此功能[36]。

5 結(jié) 論

本文綜述了釀酒酵母合成三萜類化合物合成路徑及在整個(gè)途徑起關(guān)鍵作用的CYP450 氧化酶的研究進(jìn)展。三萜化合物的生物合成是基于酵母內(nèi)的MVA 途徑，以2,3-氧化鯊烯為底物，經(jīng)鯊烯合成酶、環(huán)化酶催化作用，生成皂苷類人參二醇型與人參三醇型物質(zhì)，或經(jīng)β-香樹脂醇合成酶作用形成三萜骨架β-香樹脂醇。此時(shí)經(jīng)不同的CYP450 氧化酶（如CYP88D6、CYP72A154）與其相應(yīng)的還原酶催化作用下，歷經(jīng)多種中間產(chǎn)物，最終生成甘草次酸和皂苷類物質(zhì)。在此過(guò)程中，作為宿主的釀酒酵母不斷地被改造與優(yōu)化、相關(guān)代謝數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷涌現(xiàn)、產(chǎn)物合成途徑的不斷挖掘、遺傳改造手段和分析方法的不斷創(chuàng)新，必將能實(shí)現(xiàn)人工智能、高效的微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建，增加產(chǎn)量，降低成本，最終完成高附加值次生代謝產(chǎn)物綠色可持續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。

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