方青，張明明，陳洪奇，熊亮，趙心清，白鳳武,

（1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023；2 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

引 言

清潔能源燃料乙醇是重要的石油替代品，具有良好的發(fā)展前景[1-2]。以來(lái)源豐富且廉價(jià)的纖維質(zhì)農(nóng)林廢棄物為原料生產(chǎn)燃料乙醇，是國(guó)內(nèi)外生物能源發(fā)展的重要方向。但是，木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理過(guò)程中可產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝具有毒性的副產(chǎn)物，包括弱酸類、醛類和酚類等[3-4]。此外，利用酵母生產(chǎn)有機(jī)酸、維生素、酵母粉等商業(yè)產(chǎn)品過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生弱酸，抑制目標(biāo)產(chǎn)物的積累[5]。乙酸作為主要的毒性副產(chǎn)物之一，能引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸化，從而對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝都具有較強(qiáng)的抑制作用[3,6]，其毒性不僅包括pKa依賴的陰離子抑制作用，其造成的低pH 對(duì)細(xì)胞也產(chǎn)生損傷[7]。雖然可通過(guò)提高pH 緩解乙酸對(duì)細(xì)胞的毒性，但對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，大量使用堿液會(huì)影響生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，增加操作的復(fù)雜性[8]。國(guó)內(nèi)外利用代謝分析和遺傳育種，已經(jīng)對(duì)乙酸耐性的分子機(jī)理進(jìn)行了較為深入的研究，獲得了耐性提高的釀酒酵母菌株[3,5-6,9]。

谷胱甘肽依賴的氧化還原酶（GRX5p）是谷氧還蛋白亞家族成員之一，位于線粒體基質(zhì)內(nèi)，由GRX5基因編碼，參與Fe/S 中心的合成與裝配[10]。有研究表明，釀酒酵母細(xì)胞中乙醇誘發(fā)的活性氧（ROS）的產(chǎn)生與Fe/S 中心簇合成與裝配系統(tǒng)異常密切相關(guān)，在釀酒酵母細(xì)胞中敲除GRX5基因?qū)е?ROS 含量明顯增加[11]。GRX5p 能夠響應(yīng)過(guò)氧化氫及超氧化物的脅迫作用，在細(xì)胞抗氧化作用中發(fā)揮重要作用[10,12-13]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道其能與全局轉(zhuǎn)錄因子SPT10p 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平中起到調(diào)控蛋白表達(dá)的作用，通過(guò)調(diào)控耐性相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)提高酵母細(xì)胞的脅迫耐受性[14]。但是，GRX5過(guò)表達(dá)對(duì)釀酒酵母乙酸耐性的影響目前還不清楚。本課題組在前期蛋白組研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞活性較好的樣品中GRX5p 的蛋白表達(dá)量較高，因此本文研究了過(guò)表達(dá)GRX5對(duì)釀酒酵母乙酸耐受性的影響，為進(jìn)一步選育高效工業(yè)乙醇酵母提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌種

大腸桿菌DH5α，釀酒酵母模式菌株S288C（瑞典查爾姆斯理工大學(xué)Jens Nielsen 教授惠贈(zèng)），工業(yè)釀酒酵母Sc4126，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母粉5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0；液體YPD 培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20；斜面培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉 4，蛋白胨 3，瓊脂粉 20；種子培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 30，酵母粉4，蛋白胨 3；發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 100，酵母粉 4，蛋白胨 3，乙酸 5；固體YPD 培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，瓊脂粉 20；乙酸耐性檢測(cè)培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 20，酵母粉10，蛋白胨 20，瓊脂粉 20，乙酸 5。

1.3 過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建

以釀酒酵母S288C 基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因，所用上游引物為GRX5-F(5′-CTCCCGGGATGTTTCTCCCAAAATTCAATC-3′)，下 游 引 物 為 GRX5-R (5′-CCTTAATTAATCAACGATCTTTGGTTTCTTCT-3′)。將所得目的基因片段與pHO 整合表達(dá)載體[15]連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子。將驗(yàn)證正確含有目的基因的質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化到宿主酵母中，通過(guò)G418 抗生素篩選得到多個(gè)該目的基因過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性釀酒酵母重組菌株。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落富集培養(yǎng)后提取的基因組，利用引物GRX5-F 和G418-R（5′-AGCCGTTTCTGTAATGAAGGAG-3′）進(jìn) 行PCR 初步驗(yàn)證。大腸桿菌轉(zhuǎn)化子篩選和培養(yǎng)加入氨芐青霉素，終濃度為100 μg·ml-1；酵母菌轉(zhuǎn)化子的篩選采用G418，終濃度為200 μg·ml-1(S288C 宿主) 或300 μg·ml-1（Sc4126 宿主）。

1.4 菌種活化、耐性檢測(cè)及乙醇發(fā)酵

1.4.1 菌種活化 從斜面上接一環(huán)含有空載體的對(duì)照菌株HO-Sc4126 及含有目的基因的過(guò)表達(dá)菌株HO-GRX5-Sc4126 至種子培養(yǎng)基中，30℃，150 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)，至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 重組菌株的耐性檢測(cè) 在固體YPD 培養(yǎng)基滅菌后添加5 g·L-1乙酸，制備乙酸耐性檢測(cè)平板。將菌株活化培養(yǎng)液的OD620調(diào)至一致（1.5～2.0），10 倍梯度稀釋，取2 μl 點(diǎn)樣于乙酸耐性檢測(cè)平板，30℃培養(yǎng)2～4 d，在菌株充分生長(zhǎng)后拍照，具體方法參見文獻(xiàn)[16]。

1.4.3 乙酸脅迫下的乙醇發(fā)酵 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)所用菌株為HO-Sc4126 對(duì)照菌株及其GRX5過(guò)表達(dá)菌株。發(fā)酵培養(yǎng)基在滅菌后添加終濃度為5 g·L-1的乙酸，比較空載體菌株和GRX5過(guò)表達(dá)菌株乙酸脅迫條件下的生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵。發(fā)酵方法如下：菌株經(jīng)活化后用種子培養(yǎng)基調(diào)OD620至一致（1.5～2.0），按10%（體積）接種量轉(zhuǎn)接到含100 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml 搖瓶中，于30℃和150 r·min-1條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中每6～12 h 定時(shí)取樣，測(cè)定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)羌吧锪?，每批?shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，得到一致的結(jié)果。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖濃度、乙醇濃度、生物量及代謝物的測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度、乙醇濃度和生物量均按照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行測(cè)定。

乙醇得率（YE/CS）由式（1）計(jì)算

式中，[ethanol]max為發(fā)酵過(guò)程中最大乙醇濃度，[sugar]consumed為發(fā)酵所消耗的糖。

生物量得率(YB/CS) 用式（2）計(jì)算

式中，[biomass]max表示發(fā)酵過(guò)程積累的最大生物量(干重)。實(shí)驗(yàn)組的乙醇得率和生物量得率都以對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)表示。

乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度（YE/T）為發(fā)酵過(guò)程中最高乙醇濃度與達(dá)到這一產(chǎn)值所需時(shí)間的比值。

比乙醇生成速率（P）用式（4）計(jì)算

式（4）中生物量biomass 為細(xì)胞干重。

代謝物測(cè)定選擇3 個(gè)不同時(shí)期（對(duì)數(shù)期，靜止期，衰亡期），其對(duì)應(yīng)的不同時(shí)間如表1所示。

表1 不同時(shí)期對(duì)應(yīng)的不同發(fā)酵時(shí)間Table 1 Different phase corresponds to different time

發(fā)酵液中的代謝物分析采用Waters 1525 高效液相色譜（Waters,MA,USA）系統(tǒng)，裝配Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱（300 mm×7.8 mm,Hercules,Bio-Rad）和示差檢測(cè)器(Waters 410)。進(jìn)樣量20 μl，流動(dòng)相為0.005 mol·L-1的H2SO4溶液，流速0.5 ml·min-1，示差檢測(cè)器溫度50℃，柱溫50℃。

1.5.2 遺傳穩(wěn)定性分析 將待測(cè)菌 HO-GRX5-Sc4126 在YPD 斜面上活化后，按文獻(xiàn)方法分析其遺傳穩(wěn)定性[17]。

1.6 RNA 提取及實(shí)時(shí)定量分析

采用Sangon Biotech 試劑盒提取在1.4.3 中所述乙酸脅迫條件下發(fā)酵過(guò)程中重組菌 HO-GRX5-Sc4126 和對(duì)照菌HO-Sc4126 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒方法將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；Real-Time PCR 參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒方法進(jìn)行，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的分析。目的基因引物分別為rt-GRX5-F（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）和 rt-GRX5-R（5'-AAGACCCAGAGCTACGTGAAG-3'）；以管家基因ACT1作為內(nèi)參，引物及序列分別為ACT1-F（5'-ACCATGTTCCCAGGTATTGC-3′）和ACT1-R (5′-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3′)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 過(guò)表達(dá)GRX5 對(duì)釀酒酵母細(xì)胞乙酸耐性的影響

為了研究谷氧還蛋白基因的過(guò)表達(dá)是否能提高釀酒酵母細(xì)胞的乙酸耐受性，構(gòu)建了GRX5基因過(guò)表達(dá)的重組菌株，提取重組酵母的基因組DNA經(jīng)過(guò)PCR 驗(yàn)證，證實(shí)重組菌株構(gòu)建成功（結(jié)果未顯示）。遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示在無(wú)抗生素培養(yǎng)基傳代5 次后，隨機(jī)挑選的100 個(gè)單菌落中有97 個(gè)仍可在含抗生素的平板上正常生長(zhǎng)，說(shuō)明所得重組菌株遺傳穩(wěn)定性良好。同時(shí)比較了過(guò)表達(dá)GRX5菌株與對(duì)照菌株在5 g·L-1乙酸脅迫條件下的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果見圖1。

由圖1(a) 可以看出，以工業(yè)釀酒酵母Sc4126為宿主的重組釀酒酵母HO-GRX5-Sc4126 菌株在含乙酸的平板上生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，即在Sc4126宿主中過(guò)表達(dá)GRX5能顯著提高其對(duì)5 g·L-1乙酸的耐受性?？紤]到這種耐受性可能源于宿主遺傳背景的影響，進(jìn)一步研究了在模式酵母S288C 中過(guò)表達(dá)GRX5基因，發(fā)現(xiàn)在該宿主背景下，如圖1(b) 所示過(guò)表達(dá)菌株較對(duì)照菌株亦具有更好的乙酸耐受性，證明GRX5的過(guò)表達(dá)提高乙酸耐性的表型可能適用于多種釀酒酵母。

圖1 不同宿主中過(guò)表達(dá)GRX5 菌株與對(duì)照菌株在正常條件及5 g·L-1 乙酸脅迫條件下的生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth performance of GRX5 overexpression strain and control strain under 5 g·L-1 acetic acid stress condition and control condition (All experiments were carried out in triplicates and the same pattern was observed.Data from one representative experiment are shown)

2.2 乙酸脅迫條件下GRX5 表達(dá)水平分析及重組菌發(fā)酵性能與對(duì)照菌的比較

取乙酸脅迫條件下的重組菌和對(duì)照菌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析，結(jié)果顯示，重組菌株中GRX5基因的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照菌株的 1.87 倍（1.87±0.06，p＜0.001，n=3），表明GRX5基因的確在重組菌株中過(guò)表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌株在脅迫條件下的發(fā)酵能力，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了工業(yè)釀酒酵母Sc4126為宿主的重組釀酒酵母HO-GRX5-Sc4126菌株在5 g·L-1乙酸脅迫下的發(fā)酵性能。

2.2.1 過(guò)表達(dá)GRX5對(duì)乙酸脅迫下發(fā)酵性能的影響 乙酸脅迫條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。在乙酸脅迫條件下，過(guò)表達(dá)GRX5的菌株最高OD620為3.30，而含空載體的對(duì)照組最高OD620為2.61，過(guò)表達(dá)菌株遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株，在5 g·L-1乙酸脅迫條件下仍能維持較好的生長(zhǎng)。過(guò)表達(dá)GRX5菌株在24 h 后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而對(duì)照組則是在36 h 后才進(jìn)入對(duì)數(shù)期，過(guò)表達(dá)菌株明顯早于對(duì)照菌株，證明過(guò)表達(dá)GRX5能縮短乙酸脅迫條件下的停滯期[圖2(a)]。

圖2 HO-Sc4126 與HO-GRX5-Sc4126 菌株在5 g·L-1 乙酸下的生長(zhǎng)狀況、殘?zhí)羌耙掖糉ig.2 Cell growth,residual sugar and ethanol production of yeast strains under 5 g·L-1 acetic acid stress condition

殘?zhí)羌耙掖紨?shù)據(jù)如圖2(b)，過(guò)表達(dá)菌株在48 h內(nèi)基本消耗盡所有的葡萄糖，而對(duì)照組完全消耗則需要60 h，過(guò)表達(dá)GRX5菌株的發(fā)酵時(shí)間縮短了12 h。同時(shí)，過(guò)表達(dá)菌株的終點(diǎn)乙醇濃度高于對(duì)照菌株，分別為43.05 g·L-1和41.88 g·L-1，并且過(guò)表達(dá)菌株乙醇生成速率遠(yuǎn)快于對(duì)照菌株?？梢?，過(guò)表達(dá)GRX5縮短了該釀酒酵母在乙酸存在下的發(fā)酵周期，提高了其發(fā)酵性能。表2比較了不同菌株的乙醇發(fā)酵性能。重組菌株乙醇得率為0.431 g·g-1，相對(duì)于對(duì)照菌株的0.428 g·g-1，雖然并無(wú)顯著差異，但其發(fā)酵時(shí)間為48 h，較對(duì)照菌株的60 h 縮短了12 h，乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.897 g·L-1·h-1，明顯高于對(duì)照菌株的0.698 g·L-1·h-1，提高了約28.5%。重組菌株的乙醇比生成速率為0.209 g·(g DCW)-1·h-1，對(duì)照菌株的乙醇比生成速率為0.206 g·(g DCW)-1·h-1，二者細(xì)胞發(fā)酵活性相當(dāng)。

2.2.2 過(guò)表達(dá)GRX5對(duì)乙酸脅迫下發(fā)酵液中代謝物的影響 為了研究過(guò)表達(dá)GRX5基因?qū)σ宜崦{迫條件下的代謝物的影響，實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液中幾種代謝物進(jìn)行了測(cè)定，并根據(jù)生物量的變化選擇了3 個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行比較。

圖3(a) 為發(fā)酵液中海藻糖的比較。在不同時(shí)期，過(guò)表達(dá)GRX5的重組釀酒酵母菌株分泌的海藻糖均高于對(duì)照菌株，海藻糖本身具有保護(hù)細(xì)胞的作用，這可能與重組菌株較高的乙酸耐性有關(guān)[18]。圖3(b)則顯示無(wú)論是在靜止期、對(duì)數(shù)期還是在衰亡期，過(guò)表達(dá)GRX5菌株較對(duì)照菌株而言，胞外琥珀酸濃度更高，這可能與其更強(qiáng)的TCA 循環(huán)作用相關(guān)，因?yàn)橹亟M菌株需要通過(guò)補(bǔ)充更多的能量來(lái)應(yīng)激5乙酸的脅迫作用。乳酸是厭氧條件下葡萄糖代謝的副產(chǎn)物，圖3(c)為在不同時(shí)期發(fā)酵液中乳酸濃度，由該過(guò)表達(dá)菌株產(chǎn)生的乳酸在靜止期與對(duì)數(shù)期均多于對(duì)照菌株，間接說(shuō)明其在該5 g·L-1脅迫條件下代謝葡萄糖的能力強(qiáng)于對(duì)照菌株。過(guò)表達(dá)GRX5的重組菌株胞外甘油明顯多于對(duì)照菌株，尤其是在對(duì)數(shù)期[圖3(d)]。甘油和海藻糖都是細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)性物質(zhì)[19-20]，其含量的提高與過(guò)表達(dá)GRX5的菌株具有更強(qiáng)乙酸耐性相符合。

表2 過(guò)表達(dá)GRX5 對(duì)乙醇得率、生物量得率以及乙醇生成速率的影響Table 2 Impact of GRX5 overexpression on ethanol yield,biomass yield and ethanol volumetric production rate of Sc4126 in presence of 5 g·L-1 acetic acid

圖3 重組菌株與對(duì)照菌株在不同時(shí)期代謝物比較Fig.3 Extracellular metabolites of yeast strains in presence of 5 g·L-1 acetic acid in different growth phases

3 結(jié) 論

（1）過(guò)表達(dá)谷氧還蛋白基因GRX5能顯著提高釀酒酵母細(xì)胞對(duì)乙酸的耐受性。

（2）過(guò)表達(dá)GRX5能縮短工業(yè)釀酒酵母Sc4126在乙酸脅迫條件下的發(fā)酵周期，提高其乙醇產(chǎn)率，從而提高其發(fā)酵性能。

（3）過(guò)表達(dá)GRX5的菌株在乙酸脅迫條件下的發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了更多的脅迫保護(hù)性物質(zhì)。

[1]Ragauskas A J,Williams C K,Davison B H,Britovsek G,Cairney J,Eckert C A,Frederick Jr W J,Hallett J P,Leak D J,Liotta1C L,Mielenz J R,Murphy R,Templer R,Tschaplinski T.The path forward for biofuels and biomaterials [J].Science,2006,311(5760):484-489

[2]Xu Guihong(徐桂紅),Zhao Xinqing(趙心清),Li Ning(李寧),Bai Fengwu( 白 鳳 武).Improvement of acetic acid tolerance of self-flocculating yeast by zinc supplementation [J].CIESC Journal,2012,63(6):1823-1829

[3]Ding M Z,Wang X,Yang Y,Yuan Y J.Metabolomic study of interactive effects of phenol,furfural,and acetic acid onSaccharomyces cerevisiae[J].Omics:a Journal of Integrative Biology,2011,15(10):647-653

[4]Li Hongxing(李洪興),Zhang Xiaoran(張笑然),Shen Yu(沈煜),Dong Yongsheng(董永勝),Bao Xiaoming(鮑曉明).Inhibitors and their effects onSaccharomycescerevisiaeand relevant countermeasures in bioprocess of ethanol production from lignocellulose-a review [J].Chinese Journal of Biotechnology(生物工程學(xué)報(bào)),2009,25(9):1321-1328

[5]Zheng D Q,Wu X C,Wang P M ,Chi X Q,Tao X L,Li P,Jiang X H,Zhao Y H.Drug resistance marker-aided genome shuffling to improve acetic acid tolerance inSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(3):415-422

[6]Zhao Xinqing(趙心清),Zhang Mingming(張明明),Xu Guihong(徐桂紅),Xu Jianren(許建韌),Bai Fengwu(白鳳武).Advances in functional genomics studies underlying acetic acid tolerance ofSaccharomyces cerevisiae[J].Chinese Journal of Biotechnology(生物工程學(xué)報(bào)),2014,30(3):368-380

[7]Gaida S M,Al-Hinai M A,Indurthi D C,Nicolaou1 S A,Papoutsakis E T.Synthetic tolerance:three noncoding small RNAs,DsrA,ArcZ and RprA,acting supra-additively against acid stress [J].Nucleic Acids Research,2013,41(18):8726-8737

[8]Graves T,Narendranath N V,Dawson K,Power R.Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol productivity bySaccharomyces cerevisiaein corn mash [J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2006,33(6):469-474

[9]Hasunuma T,Sanda T,Yamada R,Yoshimura K,Ishii J,Kondo A.Metabolic pathway engineering based on metabolomics confers acetic and formic acid tolerance to a recombinant xylose-fermenting strain ofSaccharomyces cerevisiae[J].Microbial Cell Factories,2011,10(1):2-13

[10]Rodríguez-Manzaneque M T,Tamarit J,BellíG,Ros J,Herrero E.Grx5 is a mitochondrial glutaredoxin required for the activity of iron/sulfur enzymes [J].Molecular Biology of the Cell,2002,13(4):1109-1121

[11]Pérez Gallardo R V,Briones L S,Díaz Pérez A L,Gutiérrez S,Rodríguez Zavala J S,Campos García J.Reactive oxygen species production induced by ethanol inSaccharomyces cerevisiaeincreases because of a dysfunctional mitochondrial iron-sulfur cluster assembly system [J].FEMS Yeast Research,2013,13(8):804-819

[12]Kim I,Kim Y,Yoon H.Glutathione reductase fromOryza sativaincreases acquired tolerance to abiotic stresses in a genetically modifiedSaccharomyces cerevisiaestrain [J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,22(11):1557-1567

[13]Rodríguez-Manzaneque M T,Ros J,Cabiscol E,Sorribas A,Herrero E.Grx5 Glutaredoxin plays a central role in protection against protein oxidative damage inSaccharomyces cerevisiae[J].Molecular and Cellular Biology,1999,19(12):8180-8190

[14]Oh Y,Hong S,Yeon J,Cha M,Kim I.Interaction betweenSaccharomyces cerevisiaeglutaredoxin 5 and SPT10 and theirin vivofunctions [J].Free Radical Biology and Medicine,2012,52(9):1519-1530

[15]He L Y,Zhao X Q,Bai F W.Engineering industrialSaccharomyces cerevisiaestrain with the FLO1-derivative gene isolated from the flocculating yeast SPSC01 for constitutive flocculation and fuel ethanol production [J].Applied Energy,2012,100:33-40

[16]Nedjoud G,Fadila K,Mouna A,Zohra G,Sana G.Effect of zinc on growth,metabolism and activity of antioxidant enzymes in the yeast [J].Global Journal of Biodiversity Science and Management,2013,3(2):243-248

[17]Zhang Jina(張吉娜),He Xiuping(何秀萍),Guo Xuena(郭雪娜),Liu Nan(劉楠),Zhang Borun(張博潤(rùn)).Genetically modified industrial breing yeast with high-glutathione and low-diacetyl production [J].Chinese Journal of Biotechnology(生物工程學(xué)報(bào)),2006,21(6):942-946

[18]Wiemken A.Trehalose in yeast,stress protectant rather than reserve carbohydrate [J].Antonie van Leeuwenhoek,1990,58(3):209-217

[19]Wang X,Li B Z,Ding M Z,Zhang W W,Yuan Y J.Metabolomic analysis reveals key metabolites related to the rapid adaptation ofSaccharomyce cerevisiaeto multiple inhibitors of furfural,acetic acid,and phenol [J].OMICS,2013,17(3):150-159

[20]Zancan P,Sola-Penna M.Trehalose and glycerol stabilize and renature yeast inorganic pyrophosphatase inactivated by very high temperatures [J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2005,444:52-60