李瑞珍，劉志科，梁瑩瑩，郝軍紅，趙俊江，潘耀謙（河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

腦炎原蟲?。‥ncephalitozoonosis）是由兔腦炎原蟲（Encephalitozoon cuniculi）所引起的一種人畜共患病。據(jù)報(bào)道，兔腦炎原蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，可感染人、嚙齒動物、肉食動物、家畜和家禽等［1－3］。其中，家兔是腦炎原蟲的自然宿主，發(fā)病后出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，故又將此病稱為兔腦炎原蟲?。?－5］。在自然條件下，兔腦炎原蟲的隱性感染率很高，所以對活兔的腦炎原蟲病的診斷比較困難。一般認(rèn)為，血清學(xué)特異性抗兔腦炎原蟲抗體的檢出僅能證明病兔受過腦炎原蟲的感染［6－7］，而若要確診必須從腦組織特異性肉芽腫、病變的腎組織或排泌物中檢出兔腦炎原蟲。據(jù)報(bào)道，一些組織化學(xué)的特殊染色方法在涂片上可使兔腦炎原蟲特異性著染，如革蘭氏染色呈藍(lán)色、過碘酸雪夫氏染色呈淡紅色、Goodpasture染色呈紅色等［8－10］。但在病理組織切片中，這些特殊染色法有的受制于切片處理過程中有機(jī)溶劑的作用而脫色，使組織不著色，有的則因切片染色后反差較小不便觀察而容易造成誤診。為此，筆者改良了革蘭氏染色，并根據(jù)腦炎原蟲代謝的特點(diǎn)選用甲基綠派諾寧法對其進(jìn)行染色，在病理組織切片上鑒別兔腦炎原蟲方面取得了良好效果。

1 材料與方法

1．1 病兔來源 5只病兔來自河南省某獺兔養(yǎng)殖場，臨床上具有兔腦炎原蟲病的特異性神經(jīng)癥狀，初步診斷為兔腦炎原蟲病，亟需通過病理組織學(xué)和特殊染色進(jìn)行確診。

1．2 剖檢及切片 用乙醚麻醉病兔后進(jìn)行了剖檢。首先進(jìn)行了詳細(xì)的外部檢查，接著打開胸腹腔對腎臟、肝臟、脾臟、心臟和肺臟等內(nèi)臟器官進(jìn)行了檢查并采出固定，最后打開顱腔，檢查腦組織（主要樣品）后，將之取出用10%中性福爾馬林液固定，72 h后取出固定的腦組織，充分水洗，從腦前葉、額葉、枕葉和小腦4個(gè)部位橫斷，各取0．3 cm厚的腦組織，經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋等步驟，最后用Leica組織切片機(jī)切成5 μm厚的切片待染色。

1．3 普通染色 普通染色方法即蘇木素－伊紅染色（HE），試驗(yàn)所用的是梅野氏HE染色法，切片經(jīng)脫蠟水合后，用梅野氏蘇木素染色7 min，藍(lán)化，再用85%乙醇伊紅染色5 min，然后脫水、透明和封片。

1．4 改良革蘭氏染色 草酸銨結(jié)晶紫和碘溶液是按照常規(guī)配制的，將蕃紅液替換為80%酒精伊紅染色液。染色的操作步驟為:先用溶液性蠟筆在水合的切片周圍畫1個(gè)圈，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，染色15 min。流水沖洗，再滴加碘溶液，染色10 min;流水沖洗，用95%酒精脫色，再用蒸餾水洗滌，最后用80%酒精伊紅染1 min，并梯度脫水、透明和封片。

1．5 甲基綠派諾寧染色 染色液由甲液和乙液混合而成。甲液的組成為:5%派諾寧水溶液6 ml，2%甲基綠水溶液6 ml，蒸餾水16 ml混合而成。乙液為1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH=4．8），其組成為:6%冰醋酸 40 ml，13．6%醋酸鈉 60 ml混合即為pH 4．8（最好用酸度儀測試）的醋酸鹽緩沖液。將甲液和乙液分別置于4℃冰箱中備用。染色前取甲液6 ml和乙液16 ml充分混勻即為染色液。乙液在7 d內(nèi)有效，最好用前現(xiàn)配。

染色的操作很簡單，將染色液滴加在組織上，染色15 min后，吸去多余染液，滴加蒸溜水漂洗2次，充分洗去未結(jié)合的染液，再脫水、透明和封片。

2 結(jié)果與分析

2．1 臨床癥狀 5只病兔均具有典型的腦炎原蟲性神經(jīng)癥狀。站立時(shí)，病兔的頭部歪斜，全身肌肉間歇性痙攣。運(yùn)動時(shí)，病兔共濟(jì)失調(diào)，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)圈運(yùn)動（圖1A）。病重的兔子，運(yùn)動時(shí)常出現(xiàn)以身體長度為軸的翻滾。其中1例病兔的頭部已倒側(cè)于地面，眼球震顫，伴有明顯的溶晶狀體性葡萄膜炎（圖1B）。雖然病兔的運(yùn)動異常，但食欲正常，采食量沒有明顯減少。

2．2 普通染色結(jié)果 腦組織的切片經(jīng)HE染色后，在腦組織中檢出不同形態(tài)的肉芽腫。新形成的肉芽腫主要是以上皮樣細(xì)胞為主組成的細(xì)胞性肉芽腫，病程較長時(shí)則伴著肉芽組織的增生形成增生性肉芽腫，病情嚴(yán)重的肉芽腫則為壞死性肉芽腫，即增生性肉芽腫中心的上皮樣細(xì)胞壞死，即細(xì)胞核濃縮、破碎，結(jié)構(gòu)均質(zhì)紅染（圖2A）。雖然這些肉芽腫的結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯，但在HE染色的情況下均未檢出兔腦炎原蟲。

2．3 改良革蘭氏染色結(jié)果 在細(xì)胞性肉芽腫和增生性肉 芽腫的上皮樣細(xì)胞的胞漿中可檢出大量染成藍(lán)色的兔腦炎原蟲。蟲體較小，但數(shù)量較多，呈多形態(tài)散在或形成納蟲泡，位于上皮樣細(xì)胞的胞漿（圖2B）。在壞死性肉芽腫的壞死組織中，可見腦炎原蟲釋出于細(xì)胞外。存在于壞死組織內(nèi)的兔腦炎原蟲，蟲體較大，呈藍(lán)色，聚體成團(tuán)塊或散在（圖2C）。

2．4 甲基綠派諾寧染色 派諾寧對于增殖期的腦炎原蟲具有良好的染色作用。在細(xì)胞性肉芽腫和增生性肉芽腫的上皮樣細(xì)胞的胞漿中，可檢出大量染成紅色或紫紅色的兔腦炎原蟲。蟲體的形態(tài)多樣，大多呈圓形或橢圓形，也有的呈逗點(diǎn)狀或短桿狀（圖2D）。在壞死性肉芽腫的壞死組織中，也能檢出呈紅色的兔腦炎原蟲。

3 討論

3．1 病原診斷的重要性 眾所周知，兔腦炎原蟲雖然可感染多種動物及人類，但大多為隱性感染，并無明顯的臨床癥狀。在自然情況下，家兔感染腦炎原蟲后，當(dāng)病情發(fā)展到一定的階段時(shí)才出現(xiàn)以神經(jīng)癥狀為主的臨床表現(xiàn)。大量研究表明，神經(jīng)癥狀并非兔腦炎原蟲病所特有的癥狀，所以在臨床上進(jìn)行診斷時(shí)必須將其與其他能引起相似神經(jīng)癥狀的疾?。ㄈ绨褪蠗U菌病、內(nèi)耳炎、中耳炎和耳螨病等）相鑒別［11－12］。一般認(rèn)為，常用的血清學(xué)對腦炎原蟲的特異性抗體檢測技術(shù)（如間接熒光抗體技術(shù)（IFAT）和ELISA等）雖然很敏感，也很確實(shí)，但由于許多臨床上健康的家兔也可檢出中等或高滴度的腦炎原蟲特異性抗體，所以血清學(xué)特異性抗體的檢出僅能證明該家兔曾感染過腦炎原蟲，但不能最終確診。如果血清學(xué)檢查為陰性反應(yīng)，一般可排除腦炎原蟲的感染。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，對兔腦炎原蟲病的確診是一種綜合性診斷，如果能從具有神經(jīng)癥狀病兔的腦組織，發(fā)現(xiàn)特異性肉芽腫，并通過特殊染色而檢出腦炎原蟲，即可確診［9，13］。臨床上確診也需要在血清學(xué)檢查呈陽性的基礎(chǔ)上從尿沉渣中檢出兔腦炎原蟲。因此，從病理組織切片或排泌物的樣品中檢出蟲體對兔腦炎原蟲病的確診是非常重要的。

3．2 改良革蘭氏染色后的特點(diǎn) 革蘭氏染色是檢查和鑒別細(xì)菌最常用的方法之一，主要是通過涂片來檢查。一般認(rèn)為，革蘭氏染色呈陽性反應(yīng)的細(xì)菌，是因其細(xì)胞壁上具有肽聚糖。后者能形成一種網(wǎng)狀分子，當(dāng)用乙醇脫色時(shí)肽聚糖網(wǎng)孔縮小，從而保留了結(jié)晶紫碘復(fù)合物在細(xì)胞壁上，再用蕃紅染色時(shí)不再著色，而呈現(xiàn)藍(lán)色。反之，革蘭氏陰性菌由于細(xì)胞壁上沒有肽聚糖，所以不能保留結(jié)晶紫－碘復(fù)合物，而被蕃紅染成紅色。在對病理組織切片的染色過程中，染色的切片必須用酒精進(jìn)行脫水處理，而革蘭色染色液中的蕃紅經(jīng)酒精處理時(shí)嚴(yán)重脫色，以致切片變成無色，從而難以觀察和確認(rèn)病原。該研究根據(jù)革蘭氏染色的基本原理，發(fā)現(xiàn)用蕃紅對組織切片，主要起到調(diào)色、制造反差作用，故將蕃紅染液換成酒精伊紅染液，從而取得了良好的染色效果。另外，在涂片上進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)用時(shí)很短，染色效果卻很好，但在病理切片上用相同的時(shí)間，組織卻不被染色。適當(dāng)延長染色時(shí)間后，不僅使組織著色，而且使兔腦炎原蟲清楚可辨。

3．3 哌諾寧染色的特異性 大量研究表明，腦炎原蟲在細(xì)胞內(nèi)的增殖速度很快，常有大量新生的孢子分散在寄主的細(xì)胞內(nèi)或形成納蟲泡。據(jù)報(bào)道，腦炎原蟲的細(xì)胞器并不發(fā)達(dá)，比如線粒體和高爾基復(fù)合體的結(jié)構(gòu)并不存在，而是有執(zhí)行其相應(yīng)功能的酶類［14－16］。因此，在孢子的分裂增殖過程中常有大量mRNA和核糖體產(chǎn)生，從而增加了孢子內(nèi)的RNA總量。用甲基綠派諾寧染色時(shí)，甲基綠易和聚合程度高的DNA結(jié)合，使之染成綠色。派諾寧可選擇性地與聚合程度較低的RNA結(jié)合，使之染成紅色。由于兔腦炎原蟲的核較小，DNA含量低且高度緊密聚合［14］，故體積很小，被甲基綠染色的比例較小。當(dāng)孢子原漿中的mRNA和核糖體增多時(shí)，被派諾寧染色的數(shù)量增多，占孢子胞漿的比例增大，所以孢子常被染成紅色或紫紅色。因此，用派諾寧染色能使腦炎原蟲良好地著色，達(dá)到鑒別蟲體的目的。

［1］WASSON K，PEPER R L．Mammalian microsporidiosis［J］．Vet Pathol，2000，37:113 －128．

［2］ANANE S，ATTOUCHI H．Microsporidiosis:Epidemiology，clinical data and therapy［J］．Gastroenterol Clin Biol，2010，34（8/9）:450 －464．

［3］潘耀謙，劉興友，趙振升，等．腦炎原蟲病兔血液中幾種免疫指標(biāo)的檢測［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（3）:304 －308．

［4］HARCOURT-BROWN F M，HOLLOWAY H K R．Encephalitozoon cuniculiin pet rabbits［J］．Vet Rec，2003，152:427 －431．

［5］HEIM J，F(xiàn)LOCK U，SAUTER-LOUIS C，et al．Encephalitozoon cuniculiin rabbits in Germany:prevalence and sensitivity of antibody testing［J］．Vet Rec，2014，174（14）:350．

［6］CSOKAI J，GRUBER A，KUNZEL F，et al．Encephalitozoonosis in pet rabbits（Oryctolagus cuniculus）:Pathohistological findings in animals with latent infection versus clinical manifestation［J］．Parasitol Res，2009，104:629－635．

［7］HARCOURT-BROWN F M．Encephalitozoon cuniculiinfection in rabbits［J］．Semin Avian Exot Pet Med，2004，13:86 －93．

［8］李普霖．腦炎原蟲?。跩］．吉林畜牧獸醫(yī)，1988，10（1）:17 －20．

［9］JOVEETA J，GEETA K，PRASHANT G，et al．Histopathological evaluation of ocular microsporidiosis by different stains［J］．BMC Clin Path，2006，10（6）:6－12．

［10］潘耀謙，劉興友，王選年，等．兔腦炎原蟲病快速診斷的臨床病理學(xué)研究［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（2）:203 －207．

［11］KARP B E．Rabies in two privately owned domestic rabbits［J］．J Am Vet Med Assoc，1999，215:1824 －1827．

［12］ GRUBER A，PAKOZDY A，WEISSENBOCK H，et al．A retrospective study of neurological disease in 118 rabbits［J］．J Comp Pathol，2009，140（1）:31 －37．

［13］LEIPIG M，MATIASEK K，RINDER H，et al．Value of histopathology，immunohistochemistry，and real－time polymerase chain reaction in the confirmatory diagnosis ofEncephalitozoon cuniculiinfection in rabbits［J］．J Vet Diagn Invest，2013，25（1）:16 －26．

［14］KATINKA M D，DUPRAT S，CORNILLOT E，et al．Genome sequence and gene compaction of the eukaryote parasiteEncephalitozoon cuniculi［J］．Nature，2001，414（6862）:450 －453．

［15］WEBER R，MATHIS A，DEPLAZES P．Intestinal and systemic infections due to microsporidia［J］．Internist，1996，37:912 －918．

［16］HACKER C，HOWELL M，BHELLA D，et al．Strategies for maximizing ATP supply in the microsporidianEncephalitozoon cuniculi:Direct binding of mitochondria to the parasitophorous vacuole and clustering of the mitochondrial porin VDAC［J］．Cell Microbiol，2014，16（4）:565 －579．