樊曉博，謝蘭心

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)檢測研究中心，陜西 渭南　　714000）

酶標(biāo)抗原直接競爭ELISA檢測食品中氟喹諾酮類藥物多殘留

樊曉博，謝蘭心

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)檢測研究中心，陜西 渭南714000）

固相包被恩諾沙星抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）中氟喹諾酮藥物競爭結(jié)合抗體，建立了高效、高靈敏的氟喹諾酮藥物直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析檢測方法。優(yōu)化反應(yīng)條件后，得到方法的IC50為2.04 μg/L，靈敏度為0.15 μg/L，線性范圍0.3～15 μg/L；方法可以檢測12 種氟喹諾酮藥物，在生乳、雞肉、魚肉和蝦肉4 種樣品中12 種藥物的回收率為70%～121.5%。

氟喹諾酮；酶標(biāo)抗原；多殘留檢測；直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析

氟喹諾酮類（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物，為廣譜性動物抗生素，主要包括環(huán)丙沙星、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、諾氟沙星等，此類藥物殺菌活力強(qiáng)，具有高效、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)［1-2］。近年來，F(xiàn)Qs藥物在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，造成動物食品原料的藥物殘留日益嚴(yán)重［3］。此類藥物具有良好的脂溶性，會損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并引起過敏反應(yīng)和肝臟毒性［4-5］。因此，歐盟對食品中FQs殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定，我國農(nóng)業(yè)部也針對該類藥物制定了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)［6-8］。

目前，動物性食品中FQS的檢測方法主要有分子印跡-固相萃取法［9］、毛細(xì)血管法［10］、高效液相法［11-13］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［14-16］等。儀器法檢測準(zhǔn)確、可靠，但儀器設(shè)備昂貴，前處理和操作復(fù)雜，一般僅作為可疑樣品的驗(yàn)證，不適用于大批量樣品篩查。而免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)，操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，能夠適用于大通量樣品的檢測。近年來，酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunoassay，ELISA）分析方法成為檢測動物性食品中藥物殘留的研究熱點(diǎn)［17］。檢測FQS的ELISA方法從單個藥物殘留的檢測［18-20］逐漸發(fā)展到多藥物殘留免疫檢測［21-22］，多殘留檢測依靠抗體對藥物具有廣泛的交叉反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)［23-24］。本研究在單克隆抗體的基礎(chǔ)上，標(biāo)記抗原，優(yōu)化提取方法，建立直接競爭ELISA方法，檢測動物食品中至少12 種FQS藥物殘留，為動物食品的安全提供更加有效的技術(shù)保障。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

ENR、環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星、單諾沙星、氧氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、加替沙星、洛美沙星、依諾沙星、氟羅沙星、左氧氟沙星、色拉沙星、萘啶酸標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）美國Sigma公司；ENR-卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、抗ENR單克隆抗體本實(shí)驗(yàn)室自制；96孔微量反應(yīng)板美國雷博公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.2儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱美國Shell Lab公司；P200微量可調(diào)移液槍法國吉爾森公司；Wellwash MK-2洗板機(jī)、MK-3 ELISA檢測儀美國Thermo公司；恒溫振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；1-13型快速離心機(jī)美國Sigma公司；DC-12型水浴氮吹儀上海安普科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1ENR-OVA酶標(biāo)記物的制備［25］

溶解5 mg HRP于1 mL、0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液中（pH 5.6）中，加入新配制的0.1 mol/L過碘酸鈉溶液0.5 mL，置4 ℃冰箱反應(yīng)30 min。反應(yīng)完后加0.5 mL 2.0%的乙二醇溶液，4 ℃反應(yīng)30 min。向活化的酶溶液中加入0.5 mL、3 mg/mL ENR-OVA（20%甲醇溶液溶解）溶液混勻，于4 ℃先用蒸餾水透析2次，再換用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）透析2 d。透析完畢后取出，3 000 r/min離心30 min，除去沉淀，上清液即為酶標(biāo)記物。

1.3.2固相包被抗體制備

將單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至適宜質(zhì)量濃度，96 孔微孔板每孔中各加入200 μL，37 ℃放置過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔220 μL，封閉3 h。棄去封閉液，烘干，備用。

1.3.3酶標(biāo)記物效價(jià)測定

將標(biāo)記好的酶標(biāo)記物從稀釋度1∶100開始倍比稀釋，包被抗體板條中每孔依次加入100 μL倍比稀釋的酶標(biāo)記物，室溫避光反應(yīng)1 h，加入顯色液100 μL反應(yīng)20 min，終止后，在波長450 nm處測定每孔吸光度。以蒸餾水為空白對照。

1.3.4反應(yīng)條件優(yōu)化

將單克隆抗體以1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶12 000、1∶16 000五種稀釋度包被，加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL ENR-OVA酶標(biāo)記物，確定最佳包被稀釋度。用最佳包被稀釋度包板，加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和100 μL質(zhì)量濃度為0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L的酶標(biāo)記物，確定最佳的酶標(biāo)記物質(zhì)量濃度。

1.3.5直接競爭ELISA操作步驟

取包被好的板條，加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品（或處理好的樣品）到相應(yīng)的微孔中，加入分析緩沖液稀釋的酶標(biāo)記物100 μL，室溫避光反應(yīng)50 min，將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將清洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。在每一微孔加入底物溶液100 μL后，在室溫條件下避光靜置20 min。每一微孔加入100 μL反應(yīng)終止液，酶標(biāo)儀以單波長450 nm或雙波長450 nm/650 nm判讀。

1.3.6樣品處理

生乳：取4 mL待測生乳加入50 μL 3 mol/L鹽酸，振蕩混合后，3 000 r/min離心15 min，取澄清液以0.01 mol/L磷酸鹽（pH 7.4）稀釋3 倍后檢測。

組織樣品（雞肉、豬肉、魚、蝦）：將1 g已均質(zhì)樣品放入15 mL離心管中，再加入3 mL 80%甲醇溶液，振蕩混合約1 min，再以上下轉(zhuǎn)動充分混合約10 min。3 000 r/min離心15 min，取1 mL上層液于玻璃管中，50 ℃條件下利用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)溶劑吹干。向玻璃管中加入0.5 mL、4%甲醇溶液，先將殘余物完全溶解，再加入正己烷1 mL，振蕩混合約20～30 s。3 000 r/min離心15 min，利用吸管吸去包含中間乳化層部分的上層液（正己烷），再吸取下層液檢測。1.3.7考核指標(biāo)

靈敏度：測定IC10得到最低檢測限，確定體系線性檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）［26］。

式中：B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度；B0為質(zhì)量濃度為0時的平均吸光度。

特異性：將FQs各種藥品配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為待測樣品，采用ELISA方法檢測，按式（2）計(jì)算交叉反應(yīng)率。

回收率：向各種陰性樣品中分別添加不同質(zhì)量濃度的FQS標(biāo)準(zhǔn)品，處理后用ELISA方法檢測，每個質(zhì)量濃度作3 個平行測定。

1.3.8與拜發(fā)R-Biopharm氟喹諾酮試劑盒的對比

選擇本方法與對照試劑盒均可以檢測的FQs藥物，針對這些藥物選擇相同的樣品用2 種方法同時測定，以拜發(fā)試劑盒檢測結(jié)果為基準(zhǔn)計(jì)算回收率，判斷其相關(guān)性。

2　　結(jié)果與分析

2.1酶標(biāo)記物效價(jià)

由圖1可知，酶標(biāo)記抗原后，酶的活性仍很高，酶標(biāo)記物的效價(jià)達(dá)到102 400以上，可以滿足反應(yīng)體系的質(zhì)量濃度要求，表面酶標(biāo)記物制備成功。

圖 1　酶標(biāo)記物效價(jià)曲線Fig.1　The titer curve of HPR-ENR-OVA

2.2反應(yīng)條件優(yōu)化

抗原和抗體的質(zhì)量濃度對免疫檢測方法的靈敏度和特異性有重要的影響，因此有必要對合適的抗體和抗原的質(zhì)量濃度進(jìn)行探索。

2.2.1包被緩沖液的優(yōu)化

不同pH值的緩沖體系對包被效果有很大的影響。以最高吸光度（Amax）、IC50和Amax/IC50為綜合參考指標(biāo)，對比0.05 mol/L、pH 9.6碳酸鹽緩沖液、0.05 mol/L、pH 7.6磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L、pH 7.6 Tris-鹽酸緩沖液3 種包被液的包被效果。由表1可知，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液時，與其他2 種緩沖液相比，Amax最大，IC50最小，體系的靈敏度最高，因此選擇0.05 mol/L、pH 9.6碳酸鹽緩沖液作為抗體包被液。

表1　　包被液的優(yōu)化Table 1　　Optimization of coating buffer

2.2.2最佳抗體稀釋度的確定

圖 2　包被抗體稀釋度曲線Fig.2　Dilution curve of antibody by dc-ELISA

Amax與包被抗體質(zhì)量濃度呈正比，抗體質(zhì)量濃度過高時，抗體與抗原結(jié)合過多，方法的靈敏度下降。由圖2可知，當(dāng)抗體稀釋度為1∶12 000時，表示靈敏度的Amax/IC50數(shù)值最大，IC50最低，說明靈敏度最高，其Amax也在適宜的范圍內(nèi)，所以選擇包被抗體的稀釋度為1∶12 000。

2.2.3最佳酶標(biāo)抗原質(zhì)量濃度確定

圖3　ENR-OVA酶標(biāo)抗原質(zhì)量濃度曲線Fig.3　Selection of optimal HRP-ENR-OVA concentration by dc-ELISA

選擇包被抗體稀釋度為1∶12 000，選擇不同質(zhì)量濃度的酶標(biāo)抗原做直接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。隨著酶標(biāo)抗原的質(zhì)量濃度降低，Amax隨之下降，在酶標(biāo)抗原質(zhì)量濃度為0.6 mg/L時，Amax/IC50最大，IC50最小，此質(zhì)量濃度條件下體系的靈敏度最高，Amax在合適的范圍內(nèi)。故選擇此質(zhì)量濃度為最佳的酶標(biāo)抗原質(zhì)量濃度。

2.2.4甲醇體積分?jǐn)?shù)對反應(yīng)的影響

圖 4　甲醇體積分?jǐn)?shù)對dc-ELISA的影響Fig.4　Infl uence of methanol concentration on dc-ELISA

有機(jī)溶劑會對反應(yīng)體系中抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)中使用甲醇作為提取溶劑，因此需考察其體積分?jǐn)?shù)對整個反應(yīng)體系靈敏度的影響。由圖4可知，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)不超過4%時，對體系的Amax與IC50均沒有顯著的影響，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)超過8%后，Amax與IC50都開始逐漸上升，體系靈敏度下降，因此，在樣品檢測中使用4%的甲醇溶液。

2.3ELISA方法考核

2.3.1方法靈敏度

在優(yōu)化的條件下以ENR標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（0、0.1、0.3、1.1、3.3、10、30 μg/L）的對數(shù)值做橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為y=61.443 34－35.845 76x，R2=0.993 9。在一系列條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，ELISA方法的靈敏度（IC10）為0.15 μg/L，IC50為2.04 μg/L，線性關(guān)系良好，線性檢測范圍為0.3～15 μg/L。

2.3.2方法的特異性

表2　　交叉反應(yīng)率Table 2　　Cross-reactivity of antibody against FQs

將FQs的各種藥物物配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為被測物，采用ELISA方法測定。如表2所示，dc-ELISA方法具有廣泛的交叉反應(yīng)，與環(huán)丙沙星、培氟沙星等8 種交叉反應(yīng)率超過50%，檢測體系可以靈敏地檢測出動物食品中此類的藥物殘留；加替沙星、洛美沙星等4 種藥物的交叉反應(yīng)率在15%～47%之間，可在中質(zhì)量濃度時檢測藥物殘留；左氧氟沙星、色拉沙星、萘啶酸3 種藥物交叉反應(yīng)率較低，在實(shí)驗(yàn)室條件下未進(jìn)行檢測，但鑒于畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖時使用FQs藥物質(zhì)量濃度較高，因此本檢測體系具有非常廣泛的檢測范圍，可以實(shí)現(xiàn)藥物殘留的廣譜檢測。

2.3.3方法的回收率

ELISA的批內(nèi)和批間差異均低于10%。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)室評價(jià)ELISA檢測方法準(zhǔn)確度的一個重要指標(biāo)。選擇生乳、雞肉、魚肉和蝦肉等常規(guī)檢測樣品進(jìn)行添加回收率測定，選取ENR、環(huán)丙沙星等交叉反應(yīng)率較高的9 種藥物添加質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行檢測，添加質(zhì)量濃度為2、6、15 μg/L三個水平，對交叉反應(yīng)率相對較低的3 種藥物添加高質(zhì)量濃度，添加質(zhì)量濃度為20 μg/L，根據(jù)1.3.6節(jié)的方法進(jìn)行樣品處理計(jì)算不同水平的回收率。由表3可見，12 種FQs藥物的回收率在70%～121.5%之間，變異系數(shù)（coeffi cient of variation，CV）在3.7%～9.7%之間，說明該方法重復(fù)性好、精確度高，用于樣品分析準(zhǔn)確、可靠。

表3動物食品樣品添加回收率（n==33）

TTaabbllee 33 RReeccoovveerriieess ooff ffl l uuoorrooqquuiinnoolloonneess ssppiikkeedd iinnttoo aanniimmaall--ddeerriivveedd food sampleess （n == 33）

藥物名稱添加量/ （μg/L）生乳　　　雞肉　　　魚肉　　　蝦肉測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/%　測定值/ （μg/L）回收率/%　　CV/% ENR 2　1.7　85.0　8.6　2.21　110.5　7.6　2.43　121.5　9.7　1.87　93.5　8.6 6　5.2　86.6　7.8　6.19　103.0　5.8　6.1　101.6　6.4　5.39　89.8　7.5 15　14.2　94.7　9.4　17.2　114.6　6.3　16.9　112.0　9.3　13.9　92.6　9.3環(huán)丙沙星2　2.1　105.0　7.3　2.3　115.0　8.5　2.2　110.0　8.5　1.97　98.5　7.4 6　5.7　95.0　8.5　6.36　106.0　6.9　5.9　98.3　7.3　5.14　85.6　5.9 15　16.1　107.0　5.2　15.8　105.0　9.6　16.4　109.3　5.9　14.2　94.6　8.6培氟沙星2　1.58　79.0　6.4　1.73　86.5　8.8　1.69　84.5　9.5　1.45　72.5　6.4 6　4.9　81.6　8.9　4.97　82.8　7.3　4.79　79.8　9.4　4.75　79.2　7.8 15　13.6　90.6　7.8　12.9　86.0　5.6　13.1　87.3　7.5　11.8　78.6　5.3諾氟沙星2　1.55　77.5　8.2　1.49　74.5　4.9　1.48　74.0　8.7　1.42　71.0　9.2 6　4.25　70.8　4.3　5.27　87.8　7.4　5.16　86.0　6.5　4.38　73.0　7.7 15　13.2　88.0　3.7　11.6　77.3　5.6　12.4　82.6　9.4　12.6　84.0　8.5單諾沙星2　1.47　73.5　6.7　1.46　73.0　7.3　1.4　70.0　6.8　1.62　81.0　9.6 6　4.98　83.0　5.9　4.39　73.2　8.6　4.75　79.2　9.4　4.78　79.6　4.7 15　13.8　92.0　6.8　12.3　82.0　8.9　12.6　84.0　9.2　13.8　92.0　6.4氧氟沙星2　1.46　73.0　7.5　1.58　79.0　7.2　1.57　78.5　8.7　1.53　76.5　8.5 6　4.55　75.8　8.3　4.78　79.6　6.4　4.67　77.8　7.3　4.48　74.6　7.2 15　11.1　74.0　9.9　12.1　80.6　6.9　11.5　76.6　7.8　13.2　88.0　5.8惡喹酸2　1.4　70　6.8　1.48　74.0　8.9　1.56　78.0　5.6　1.48　74.0　8.6 6　4.42　73.6　7.6　4.67　77.8　10　4.77　79.5　8.9　4.39　73.2　7.5 15　12.2　81.0　8.5　11.9　79.3　8.7　12.9　86.0　7.6　12.7　84.7　9.4氟甲喹2　1.52　76.0　5.9　1.53　76.5　9.3　1.48　74.0　7.8　1.53　76.5　5.8 6　4.87　81.1　4.7　4.74　79.0　7.6　4.55　75.8　8.4　4.93　82.2　9.7 15　11.3　75.3　6.1　11.6　77.3　8.4　12.8　85.3　9.1　11.8　78.7　9.3加替沙星2　1.45　72.5　7.3　1.56　78.0　9.6　1.48　74.0　9.6　1.62　81.0　4.8 6　4.36　72.6　8.2　4.77　79.5　8.5　4.32　72.0　8.5　4.98　83.0　6.5 15　12.4　82.6　7.6　11.2　74.6　9.2　11.6　77.3　6.5　12.7　84.7　8.4諾美沙星　　20　17.8　89.0　4.8　16.9　84.5　7.6　15.9　79.5　7.9　18.3　91.5　6.9依諾沙星　　20　17.2　86.0　9.2　17.5　87.5　5.5　17.3　86.5　8.4　17.5　87.5　8.9氟羅沙星　　20　16.8　84.0　8.2　16.2　81.0　8.9　16.1　80.5　5.7　17.2　86.0　7.4

2.3.4與拜發(fā)R-Biopharm氟喹諾酮試劑盒的對比

表 4　2 種ELISA方法比較（n==33）Taabbllee 44 　　CCoommppaarriissoonn ooff tthhee rreessuullttss oobbttaaiinneedd ffoorr cchhiicckkeenn aanndd sshhrriimmpp with two different ELISA kits （n == 33）

參考拜發(fā)氟喹諾酮試劑盒的檢測參數(shù)，選擇ENR、環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹作為檢測藥物，2 種方法同時檢測含有5 種FQs藥物的雞肉和蝦肉樣品同時進(jìn)行測定，設(shè)置兩個質(zhì)量濃度水平。如表4所示，以進(jìn)口試劑盒測定的藥物質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)，2 種檢測樣品中5 種藥物的回收率在84.7%～104.7%之間，2 種方法之間有很高的相關(guān)性，建立的方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以作為動物食品樣品中FQs藥物殘留的定量檢測方法。

3　　結(jié) 論

本研究利用HRP成功標(biāo)記了抗原，標(biāo)記后酶標(biāo)記物的效價(jià)可以滿足檢測要求，建立了直接競爭氟喹諾酮ELISA分析方法。該方法在優(yōu)化體系條件后，檢測線性范圍為0.3～15 μg/L，最低檢測限為0.15 μg/L，IC50為2.04 μg/L，抗體對15 種FQs藥物具有交叉反應(yīng)，對其中至少12 種FQs藥物可以進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，4 種動物食品樣品中回收率在70%～121.5%之間。相比現(xiàn)有的ELISA檢測方法，本方法檢測速度快、靈敏度和穩(wěn)定性有了明顯的提高，藥物檢測范圍廣。與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行比較，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以滿足現(xiàn)有的檢測需要，具有良好的應(yīng)用前景。

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Direct Competitive ELISA with HRP-Labeled Antigen for Multiresidue Determination of Fluoroquinolones in Animal-Derived Food

FAN Xiaobo， XIE Lanxin
（Weinan Testing and Inspection and Research Center of Agricultural Products and Food，Weinan Vocational and Technical College， Weinan714000， China）

In this study， a rapid and high sensitive direct competitive enzyme-linked immunoassay （dc-ELISA） method based on antigen labeled by horseradish peroxidase （HRP） was established and successfully applied to detect fl uoroquinolones （FQs）in animal-derived food. In the direct competitive assay， monoclonal antibody was bound to the surface of a microtiter plate，and the standards （or the sample） competed with antigen for the antibody binding sites. Under optimized assay conditions，the IC50of dc-ELISA was 2.04 μg/L， the limit of detection was 0.15 μg/L， and the linear range was 0.3-15 μg/L. This method could detect 12 kinds of FQs with recoveries from milk， chicken， fi sh and shrimp in the range from 70% to 121.5%. Key words: fl uoroquinolones； horseradish peroxidase （HRP）-labeled antigen； multiresidue determination； direct competitive ELISA （dc-ELISA）

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0265-05

10.7506/spkx1002-6630-201524049

2015-03-02

渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（WZYQ201405）

樊曉博（1984—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称房焖贆z測技術(shù)。E-mail：shine2786@163.com