梅光明，郭遠明，張小軍，朱敬萍，薛 彬，宋 凱，顧蓓喬

（浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站，浙江 舟山　　316121）

浙江沿海海產(chǎn)品中汞形態(tài)分析測定與分布特征

梅光明，郭遠明，張小軍，朱敬萍，薛 彬，宋 凱，顧蓓喬*

（浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站，浙江 舟山316121）

建立水產(chǎn)品中汞形態(tài)分析的鹽酸溶液提取、高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀測定方法，從提取劑鹽酸溶液濃度、絡(luò)合劑選擇、泵速和氣體流速方面進行條件優(yōu)化，方法學(xué)評價結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、精密性好；采自浙江沿海的160 個實際樣品測定數(shù)據(jù)證明大部分水產(chǎn)品肌肉中都有甲基汞檢出，甲基汞是水產(chǎn)品肌肉中存在的主要形態(tài)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)的65.0%～95.2%，食物鏈級別較高的食肉魚類甲基汞含量高于普通魚類；海產(chǎn)品中魚皮和內(nèi)臟的總汞含量值高于其鰓和肌肉部位的總汞含量值，且在內(nèi)臟、鰓和魚皮中主要是以無機汞形態(tài)存在。

汞；甲基汞；液相色譜-原子熒光光譜法；形態(tài)分析；海產(chǎn)品

汞是自然界中對人類最具有危害作用的重金屬元素之一，分為無機汞（游離汞和汞離子）和有機汞（甲基汞、乙基汞和苯基汞等），有機汞毒性大于無機汞，其中甲基汞毒性最強。環(huán)境中的無機汞可在微生物和化學(xué)變化作用下轉(zhuǎn)變成甲基汞［1-3］。海洋魚類通過生物累積放大作用，可使體內(nèi)甲基汞濃度達到環(huán)境水體中濃度的104～106倍［4］，因此海產(chǎn)品成為一般人群甲基汞暴露的主要來源［5］。GB 2762—2012《食品中污染物限量》［6］規(guī)定總汞值不超出甲基汞限量值時，可以用總汞值代替甲基汞值。目前GB/T 5009.17—2003《食品中總汞及有機汞的測定》［7］和GB/T 17132—1997《環(huán)境甲基汞的測定：氣相色譜法》［8］中水產(chǎn)品甲基汞測定的檢測方法都采用氣相色譜法，存在檢出限高、衍生步驟繁瑣和耗時費力等缺點，因此很多檢測機構(gòu)目前都只測定水產(chǎn)品中總汞值。近年來國家越來越重視的食品安全風(fēng)險評估制度對危害物識別技術(shù)提出了更高的要求，準(zhǔn)確把握水產(chǎn)品中各種形態(tài)汞污染物分布水平是科學(xué)合理評估水產(chǎn)品汞污染安全風(fēng)險的基礎(chǔ)。高效液相色譜-原子熒光光譜（high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-AFS）法結(jié)合液相色譜的高效分離特點和原子熒光光譜法的高靈敏度優(yōu)勢，被用于汞［9-1 3］、硒［14-16］、銻［17-18］和砷［19-21］等元素形態(tài)分析研究。筆者前期研究也采用HPLC-AFS法測定水產(chǎn)品中3 種汞含量，該方法采用C18固相萃取進行樣品凈化，取得了較好的實驗結(jié)果［11-12］，但因水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量高，水溶性提取溶液黏度大，部分樣品在固相萃取操作中易發(fā)生堵塞，通常需要真空減壓操作，過程相對費時耗力。本實驗對該前處理方法進行改進，省去了固相萃取過程，在減少耗時的同時也降低檢測成本，運用改進后的方法對浙江沿海海產(chǎn)品進行測定，研究汞形態(tài)物在不同品種海產(chǎn)品和海產(chǎn)品不同部位中的含量分布特征，對科學(xué)合理評估浙江沿海海產(chǎn)品汞污染安全風(fēng)險和指導(dǎo)人們建立健康的水產(chǎn)消費習(xí)慣都具有重要意義。

1　　材料與方法

1.1樣品來源

160 個海捕產(chǎn)品來自浙江溫州、臺州和舟山三地的水產(chǎn)碼頭或漁船，大菱鲆購自舟山沈家門東河市場，魷魚為舟山遠洋漁業(yè)公司采自西南大西洋的阿根廷滑柔魚，三文魚和大眼金槍魚購自舟山生鮮超市，樣品按要求處理后保存在－18 ℃冷庫中備用。

1.2儀器與試劑

Prostar 210液相色譜泵美國Varian公司；SA-10原子熒光形態(tài)分析儀（配SAP-10形態(tài)分析預(yù)處理裝置）北京吉天儀器有限公司；Ethos 1微波消解系統(tǒng)意大利Milestone公司；AL204型電子天平上海梅特勒-托利多儀器有限公司；T18基本型漩渦振蕩器德國IKA公司；Centrifuge 5810臺式高速離心機德國艾本德公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器常州國華儀器設(shè)備廠。

汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，GSB04-1729-2004）國家有色金屬及電子材料分析測試中心；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（76.6 μg/g，GBW08675）、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（75.3 μg/g，GBW（E）081524） 中國計量科學(xué)研究院；紫菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10023）地球物理地球化學(xué)勘查研究所；金槍魚中總汞和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BCR-463）歐洲標(biāo)準(zhǔn)局；乙腈（色譜純）德國Merk公司、乙酸銨（色譜純）美國Sigma公司；L-半胱氨酸（純度≥98.0%）、過硫酸鉀德國CNW公司；其他試劑均為優(yōu)級純國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3方法

1.3.1總汞的測定

參考GB/T 5009.17—2003方法進行，樣品微波消解后用原子熒光儀進行總汞測定［7］。

1.3.2汞形態(tài)分析測定

稱取1.0～2.0 g樣品，加入5 mol/L鹽酸溶液5 mL，漩渦混勻2 min后在40 ℃、200 r/min條件下氣浴振蕩過夜，7 000 r/min離心10 min后取上清液2 mL至15 mL離心管中，逐滴加入6 mol/L氫氧化鈉溶液1.5 mL，加入10 g/L半胱氨酸溶液定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC-AFS形態(tài)分析。

HPLC儀條件：色譜柱C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相60 mmol/L乙酸銨溶液（含5%乙腈和1.2 g/L半胱氨酸），流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；手動進樣量100 μL。

形態(tài)分析預(yù)處理裝置條件：紫外燈開；泵速設(shè)置為50 r/min；載流7%鹽酸溶液（按體積分?jǐn)?shù)）；還原劑5.0 g/L KOH+15 g/L KBH4；氧化劑5.0 g/L KOH+10 g/L

K2S2O8。

AFS儀條件：總電流30 mA；負高壓270 V；載氣（氬氣）流速300 mL/min；屏蔽氣（氬氣）流速800 mL/min。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

總汞測定曲線：配制0.10 μg/mL汞標(biāo)準(zhǔn)使用液（含10% HNO3），利用AFS-9230儀器自動稀釋功能配成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μg/L和1.00 μg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

汞形態(tài)測定曲線：配制0.50 μg/mL含Hg2+、CH3Hg和CH3CH2Hg的3 種汞混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用純水稀釋成1、2、5、10、20、50 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供HPLC-AFS分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，汞質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.4質(zhì)量控制

總汞和汞形態(tài)測定分別采用紫菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和金槍魚中總汞和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為方法的質(zhì)量控制，驗證方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2　　結(jié)果與分析

2.1提取條件的確定

生物樣品中汞形態(tài)測定的前處理提取方法主要有堿-甲醇溶液法［22-24］和酸提法［25-29］，利用堿或酸溶液對生物組織進行水解從而釋放出汞形態(tài)物進行測定。堿提法具有消解充分和均勻的特點，同時存在操作復(fù)雜和后續(xù)酸堿中和劇烈放熱反應(yīng)容易導(dǎo)致部分汞化合物揮發(fā)損失的缺點，也有研究表明堿提法中汞形態(tài)物之間發(fā)生轉(zhuǎn)化的機率高于酸提法［28］。樣品凈化方法有稀釋取樣法［23，26，29］、液液萃取法［22，24-25，27］和SPE固相萃取法［11-12，28］。因部分水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和脂肪含量高的特點，采用C18固相萃取小柱對提取液進行凈化時易發(fā)生柱堵塞，通常需要真空減壓操作，整個過程耗時費力。本研究采用酸提法和稀釋取樣測定作為汞形態(tài)測定的前處理方法，對酸解濃度進行了優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取0.1 g的BCR-463，分別以1、2、3、4、5、6、7 mol/L的鹽酸溶液提取，后續(xù)步驟按照1.3.2節(jié)方法處理后進行形態(tài)測定，提取劑鹽酸濃度對響應(yīng)峰面積影響情況見圖1。

圖 1　　提取劑鹽酸濃度對峰面積影響Fig.1　　Effect of hydrochloric acid concentration on peak area

如圖1所示，在1～5 mol/L范圍內(nèi)，隨著鹽酸濃度的增加，酸解效果越來越明顯，與魚肉脂肪和蛋白質(zhì)等組織結(jié)合的汞充分釋放被提取出來，因此無機汞和甲基汞峰面積呈增加趨勢；當(dāng)鹽酸濃度大于6 mol/L時，提取效率反而下降，原因可能是因為酸堿中和反應(yīng)釋放熱量，放熱量也隨鹽酸濃度增加而增加，導(dǎo)致汞元素因揮發(fā)而損失。因此采用5 mol/L鹽酸作為提取劑達到最佳效果。

2.2絡(luò)合劑的選擇

流動相中不添加絡(luò)合劑，色譜圖沒有目標(biāo)峰出現(xiàn)，這是因為C18色譜柱中殘留的硅醇基會吸附汞導(dǎo)致無法被洗脫下來，加入的絡(luò)合劑可以和3 種形態(tài)汞結(jié)合形成非極性化合物，增加在C18柱材料中吸附作用，實現(xiàn)較好分離。常用的絡(luò)合劑2-巰基乙醇和L-半胱氨酸 是利用—SH與汞結(jié)合形成巰基-汞復(fù)合物，研究比較了流動相60 mmol/L乙酸銨溶液（含5%乙腈 和1.2 g/L半胱氨酸）和流動相60 mmol/L乙酸銨溶液（含5%乙腈和0.1% 2-巰基乙醇）對標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定影響。實驗表明在含2-巰基乙醇流動相下，3 種形態(tài)汞出峰順序先后為甲基汞、無機汞和乙基汞，出峰時間分別為10.6、13.1 min和27.0 min，含L-半胱氨酸流動相下出峰順序先后為無機汞、甲基汞和乙基汞，出峰時間明顯縮短，6 min內(nèi)即可實現(xiàn)3 種形態(tài)汞的分離測定。2-巰基乙醇流動相條件下峰形較尖銳，峰響應(yīng)面積比后者大，特別是改善了甲基汞拖尾峰形，但考慮到2-巰基乙醇屬于管制有毒試劑，價格較高，有強烈的特殊臭味，且分析時間較長，故采用L-半胱氨酸為流動相添加劑。圖2為采用L-半胱氨酸為絡(luò)合劑條件下的3 種形態(tài)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖 2　3 種形態(tài)汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定色譜圖（100 μgg//LL）Fig.2　Chromatograms of standard solutions of three mercury species （10 μg/L）

2.3形態(tài)預(yù)處理條件確定

HPLC-AFS法測定汞形態(tài)的原理是首先利用紫外燈照射和氧化劑K2S2O8溶液作用使色譜分離出的有機汞經(jīng)在線消解成無機汞，再與還原劑KBH4溶液和載流鹽酸溶液反應(yīng)，生成原子汞蒸氣進入AFS儀進行測定。K2S2O8溶液濃度直接影響到有機汞向無機汞的轉(zhuǎn)化效率，其質(zhì)量濃度過低，有機汞氧化不夠完全，而質(zhì)量濃度過高，過量的K2S2O8又會與KBH4發(fā)生反應(yīng)，影響KBH4與無機汞的反應(yīng)，降低靈敏度。KBH4質(zhì)量濃度對測定也有重要影響，質(zhì)量濃度過高會反應(yīng)產(chǎn)生過多的氫氣，引起氣相干擾和靈敏度降低，質(zhì)量濃度過低又難以和無機汞反應(yīng)完全。利用標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，筆者前期研究已通過實驗優(yōu)化確定載流液7%鹽酸溶液、還原劑15 g/L KBH4（含5 g/L KOH）和氧化劑10 g/L K2S2O8（含5 g/L KOH）條件下給出最大熒光響應(yīng)值［11-12］。

形態(tài)分析預(yù)處理裝置SAP-10對氧化劑、載流和還原劑都使用同樣的泵速提升液體，泵速的大小直接影響K2S2O8溶液、KBH4溶液和載流鹽酸溶液的進液流速，進而影響到氧化還原反應(yīng)程度和氫氣發(fā)生量。對泵速大小進行優(yōu)化比較，以10 μg/L的3 種形態(tài)汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，獲得了泵速從20～70 r/min條件下各目標(biāo)物的峰響應(yīng)面積值（圖3）。結(jié)果表明泵速50 r/min條件下各目標(biāo)物峰的響應(yīng)面積最大，過高或過低的泵速均不利于測定。

圖 3　泵轉(zhuǎn)速對峰面積的影響Fig.3　Effect of pump rotating speed on peak area

2.4氣體流速的確定

原子熒光測定采用氬氣作為載氣和屏蔽氣，載氣流速過低會導(dǎo)致汞蒸氣不能被及時吹入檢測器，造成色譜峰展寬和靈敏度下降，載氣流量過大又會使氫化物稀釋，甚至導(dǎo)致火焰熄滅。屏蔽氣的流速過小或過大會影響到氬氫火焰的穩(wěn)定性。因此合適的載氣和屏蔽氣流速對獲得穩(wěn)定和高響應(yīng)信號有重要意義。載氣流速（100～800 mL/min）和屏蔽氣流速（300～1 000 mL/min）對10 μg/L的3 種形態(tài)汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰響應(yīng)面積影響情況見圖4和圖5所示，確定載氣流速為300 mL/min、屏蔽氣流速為800 mL/min條件下，目標(biāo)物峰面積達到最佳值。

圖 4　　載氣流速對峰面積的影響Fig.4　　Effect of carrier gas fl ow rate on peak area

圖 5　屏蔽氣流速對峰面積的影響Fig.5　Effect of shield gas fl ow rate on peak area

2.5方法學(xué)評價

表1　汞測定的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限TTaabbllee 11 　　LLiinneeaarr rraannggeess， rreeggrreessssiioonn eeqquuaattiioonnss， ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffi i cciieennttss，aanndd qquuaannttiittaattiioonn lliimmiittss ooff ddiiffffeerreenntt mmeerrccuurryy ssppeecciieess

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光響應(yīng)峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總汞和3 種形態(tài)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液測定線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限見表1，定量檢出限以10 倍信噪比的方法計算得出。總汞測定中，GBW 10023紫菜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值為（0.016±0.004）mg/kg，質(zhì)控實驗3 次平行測定平均值為0.015 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.53%；BCR-463金槍魚中總汞和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值為總汞（2.85±0.16）mg/kg，甲基汞（3.04±0.16）mg/kg，質(zhì)控實驗3 次平行測定總汞平均值為2.92 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.76%，3 次平行測定甲基汞平均值為2.90 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.80%。結(jié)果表明總汞和甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定數(shù)據(jù)均在定值規(guī)定范圍內(nèi)，方法的準(zhǔn)確度和精密度均能夠滿足檢測要求。

2.6實際樣品汞測定結(jié)果

結(jié)合2014年農(nóng)業(yè)部下達的捕撈水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測工作，對采自浙江溫州、臺州和舟山3 個近海海域的160 個捕撈樣品（品種包括梅童魚、海鰻、鯧魚、帶魚、鯔魚、馬面鲀、鲅魚、小黃魚、鮟鱇魚、沙丁魚、對蝦、鷹爪蝦和鮐魚）進行總汞和有機汞測定（表2）。結(jié)果表明150 個樣品均有甲基汞檢出，檢出率為93.8%，乙基汞均未檢出，甲基汞平均含量值比較高的捕撈產(chǎn)品種集中在海鰻（最高含量0.323 mg/kg）、帶魚（最高含量0.536 mg/kg）、鲅魚（最高含量0.158 mg/kg）和鮟鱇魚（最高含量0.253 mg/kg）。分析原因為這幾種魚在生活習(xí)性上均為肉食性魚類，對甲基汞的生物富集能力比一般魚類要高，這一點與有相關(guān)研究結(jié)論一致［30-31］。同時為了解外海或遠洋水產(chǎn)品汞污染狀況，從舟山生鮮市場和遠洋漁業(yè)公司采集了三文魚、大眼金槍魚、遠洋阿根廷魷魚和鯊魚樣品進行有機汞測定，結(jié)果顯示金槍魚和鯊魚樣品甲基汞含量較高，3 個金槍魚樣品甲基汞含量分別為0.47、0.88 mg/kg和0.95 mg/kg，2 個鯊魚樣品甲基汞含量均值為0.21 mg/kg，進一步證實了處于食物鏈頂端、營養(yǎng)級別高的魚類富集汞能力更強。對總汞檢測結(jié)果表明在甲基汞有檢出樣品中，甲基汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比例范圍為65.0%～95.2%，說明汞水產(chǎn)品肌肉中汞元素主要是以甲基汞的形式存在。

圖6為兩個海鰻樣品測定色譜圖（樣品1，無機汞0.016 mg/kg，甲基汞0.185 mg/kg；樣品2，無機汞0.026 mg/kg，甲基汞0.075 mg/kg），從該測定色譜圖中也可以看出甲基汞是最主要的存在形態(tài)。

圖 6　海鰻樣品測定色譜圖Fig.6　Chromatogram of mercury species in eel samples

為進一步了解汞元素在魚體類不同部位的分布特征，選擇5 種魚類分肌肉、內(nèi)臟（含肝臟等）、魚鰓和魚皮4 個部位進行總汞和有機汞的測定（表 3）。5 種水產(chǎn)品的魚皮和內(nèi)臟中總汞含量值最高，均高于鰓和肌肉部位的總汞含量，肌肉中汞主要以甲基汞的形式存在，而在內(nèi)臟、鰓和魚皮中主要是以無機汞形式存在，原因可能在于肌肉因脂肪含量最高，甲基汞作為脂溶性物質(zhì)主要富集在肌肉組織的脂肪中，內(nèi)臟作為魚體的解毒器官，吸收富集汞能力也較強。魚鰓器官與外界環(huán)境相通，交換能力較強，因此當(dāng)環(huán)境水體中汞污染嚴(yán)重時，魚鰓中汞含量 值也會較高。

表2　魚肉樣品中有機汞測定結(jié)果TTaabbllee 22 　　CCoonntteennttss ooff oorrggaanniicc mmeerrccuurryy iinn aaqquuaattiicc pprroodduuccttss

表3　魚體內(nèi)汞分布特征Taabbllee 33 　　DDiissttrriibbuuttiioonn cchhaarraacctteerriissttiiccss ooff mmeerrccuurryy iinn aaqquuaattiicc pprroodduuccttss

3　　結(jié) 論

建立了水產(chǎn)品中汞形態(tài)分析的鹽酸提取，然后采用HPLC-AFS測定方法，方法學(xué)評價表明該方法準(zhǔn)確度高、精密性好。運用該方法進行實際樣品測定結(jié)果表明絕大部分水產(chǎn)品肌肉中都有甲基汞檢出，且甲基汞是水產(chǎn)品肌肉中汞元素存在的主要形態(tài)；分部位檢測結(jié)果說明水產(chǎn)品魚皮和內(nèi)臟的總汞含量值高于其鰓和肌肉部位的總汞含量值，在內(nèi)臟、鰓和魚皮中汞元素主要是以無機汞形態(tài)存在。

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Analysis and Distribution Characteristics of Mercury Species in Seafood from the Coast of Zhejiang Province

MEI Guangming， GUO Yuanming， ZHANG Xiaojun， ZHU Jingping， XUE Bin， SONG Kai， GU Beiqiao*
（Scientifi c Observation and Experiment Station of Fishery Resources in Key Fishing Grounds， Ministry of Agriculture，Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province， Zhoushan316121， China）

A high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry method was developed for the determination of mercury species in aquatic products using hydrochloric acid solution as the extractant. Under the optimized conditions of hydrochloric acid concentration， complexant， pump speed and gas fl ow， the method showed a high accuracy and good precision. Methylmercury was detected in muscles of most of the 160 seafood samples from the coast of Zhejiang province. Methylmercury was the main form detected in muscle， which accounted for 65.0%-95.2% of the total mercury content in mass fraction. Methylmercury content in carnivorous fi sh was higher than that in ordinary fi sh. The total mercury contents in skin and viscera were higher than those in gill and muscle， and inorganic mercury was the main form in viscera， gills and skin.

mercury； methylmercury； high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry；speciation analysis； seafood

O657.3

A

1002-6630（2015）24-0229-06

10.7506/spkx1002-6630-201524043

2015-01-15

浙江省科技計劃項目（2012F30021；2014F 3002 4）

梅光明（1984—），男，工程師，碩士，研究方向為漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品安全分析。E-mail：meigm123@163.com

顧蓓喬（1963—），男，工程師，本科，研究方向為漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品安全分析。E-mail：gbq@zjou.edu.cn