胡志和，夏 磊，孫振剛，武文起，馮永強(qiáng)，薛 璐，劉蓄瑾，賈 瑩

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津　300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300134；3.天津海河乳業(yè)有限公司，天津　300402）

酪蛋白水解物中ACE抑制肽分離及氨基酸序列分析

胡志和1，2，夏 磊1，孫振剛3，武文起3，馮永強(qiáng)3，薛 璐1，2，劉蓄瑾1，賈 瑩1

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；
2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；3.天津海河乳業(yè)有限公司，天津300402）

以牛乳酪蛋白為底物，先經(jīng)胃蛋白酶水解，再經(jīng)胰蛋白酶水解，從水解物中分離獲得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽并確定其氨基酸序列。酪蛋白的雙酶水解物經(jīng)超濾和葡聚糖凝膠色譜分離，分離得到3 個(gè)組分，收集高ACE活性抑制效果組分Ⅱ和Ⅲ。采用離子色譜法分析水解片段的氨基酸組成，液相色譜-質(zhì)譜法分析水解片段的氨基酸序列，采用固相合成法制備獲得的短肽片段，用分光光度法檢測(cè)ACE活性抑制效果。結(jié)果表明，組分Ⅱ包含纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 種氨基酸，組分Ⅲ包含痕量的絲氨酸和酪氨酸；將組分Ⅱ和Ⅲ經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析，獲得8 個(gè)片段，其中，αs2-f （56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用，其IC50值分別為11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。

牛乳酪蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；抑制肽

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種多功能酶，在體內(nèi)的升壓系統(tǒng)（腎素-血管緊張素系統(tǒng)）和降壓系統(tǒng)（激肽-激肽釋放酶系統(tǒng)）中起著重要的調(diào)節(jié)作用［1-3］。ACE抑制劑（ACE inhibitor，ACEI）也是心血管和高血壓疾病治療使用較多的藥物［4］。然而，包括ACEI在內(nèi)的合成的降壓藥物，對(duì)人體均有副作用［5-7］，因此，人們將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到天然抗高血壓產(chǎn)物的開發(fā)。近年來，大量的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在食物蛋白中存在多種生物活性片段，可通過蛋白酶水解釋放出來，其中包括ACE抑制肽。目前，研究人員分別從乳蛋白［8-15］、墨魚蛋白［16］、蜥魚蛋白［17］、蝦蛋白［18］、蠶蛹蛋白［19］、雞蛋清蛋白［20］、鯵蛋白［21］、魚類蛋白［22］、花生蛋白［23］、大豆蛋白［24-25］、螺旋藻蛋白［26］等蛋白的酶解物中分離出ACE抑制肽，并確定了肽的氨基酸序列。

本研究以牛乳酪蛋白為原料，先經(jīng)胃蛋白酶水解，再用胰蛋白酶水解，從水解產(chǎn)物中分離純化具有ACE活性抑制作用的肽片段，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酪蛋白天津海河乳業(yè)有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-hisleu hydrate，HHL）（H1635-25 mg）、ACE（A6778-0.25UN）、18 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉、NaAC（均為分析純）天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、乙腈（色譜級(jí)）天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；四硼酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯（均為分析純）天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醇（高效液相色譜級(jí)）、HAC（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）天津南開允公合成技術(shù)有限公司；Sephadex G-15固體粉末Pharmacia公司。

1.2儀器與設(shè)備

L535-1低速離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；1.0 cm×100 cm層析柱、CXG-1電腦恒溫層析柜、HD-3紫外檢測(cè)儀、DBS-100電腦全自動(dòng)部份收集器、HD-A電腦采集器上海滬西分析儀器廠有限公司；pH儀德國賽得利斯北京有限公司；DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司；UV-2100型分光光度計(jì)美國Unico公司；Dionex ICS-3000型金電極電化學(xué)檢測(cè)器、AminoPac PA-10型分析柱（2 mm×250 mm）、AminoPac PA-10型預(yù)柱（2 mm×50 mm）、Amino Acids電位波形（pH，Ag，AgCl Reference）、LTQ XL型色譜-質(zhì)譜檢測(cè)儀器、LCMC/MC sequent軟件美國賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1酪蛋白的雙酶水解物的制備

采用楊銘等［27］的方法制備水解產(chǎn)物，并進(jìn)行改良。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%酪蛋白的水溶液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0，加熱并保持溫度37 ℃，按照酶與底物比為1∶100（g/g）加入胃蛋白酶水解3 h后用沸水浴滅酶10 min。水解液冷卻至48 ℃，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.7，加入胰蛋白酶，酶與底物比為1∶500（g/g），水解3 h后，用沸水浴滅酶10 min。冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0。在4 000 r/min條件下離心15 min。上清液用截留分子質(zhì)量為6 kD的中空纖維膜組件在0.05～0.10 MPa壓力范圍內(nèi)循環(huán)超濾，獲得分子質(zhì)量小于6 kD的溶液，經(jīng)冷凍干燥后待用。

用洗脫緩沖溶液（濃度0.02 mol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液）將冷凍干燥粉末配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL溶液，通過Sephadex G-15進(jìn)行分離。分離條件：上樣量3 mL，紫外檢測(cè)波長280 nm，洗脫速率0.4 mL/min，按7.5 min/管進(jìn)行收集，獲得3 個(gè)分離組分。采用分光光度法（HHL方法［28］）檢測(cè)酪蛋白雙酶水解物、水解物經(jīng)截留分子質(zhì)量6 kD超濾膜超濾的透出物和3 個(gè)組分的ACE抑制效果的IC50值，雙酶水解物IC50值為560 μg/mL，超濾透出物IC50值為250 μg/mL，組分Ⅰ為123.41 μg/mL，組分Ⅱ?yàn)?6.67 μg/mL，組分Ⅲ為64.29 μg/mL［27］。按公式（1）計(jì)算ACE抑制率。

式中：A為反應(yīng)中ACE抑制劑與ACE同時(shí)存在的吸光度；B為反應(yīng)中不加抑制劑的吸光度，即對(duì)照；C為ACE 和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

1.3.2水解片段的氨基酸序列分析

將ACE活性抑制效果較好的組分Ⅱ和Ⅲ中的片段進(jìn)行分析。

1.3.2.1氨基酸組成的化學(xué)檢測(cè)

1）樣品處理：分別稱取大約1 mg的組分Ⅱ和組分Ⅲ于水解管中，加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，充入高純氮?dú)?，在充氣狀態(tài)下擰緊螺絲蓋，放在（110±1） ℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解24 h之后取出并進(jìn)行冷凍干燥，待使用時(shí)再復(fù)溶至1 mL。

從復(fù)溶的溶液中取出200 μL樣品溶液，稀釋至4 mL，用IC-C18固相萃取小柱串聯(lián)，并以0.22 μm的尼龍針筒過濾器過濾純化，收集1 mL濾出液，待上樣。其中，IC-C18固相萃取小柱串聯(lián)提前經(jīng)過5 mL甲醇和10 mL純水活化、洗滌。

2）標(biāo)準(zhǔn)品：5 μmol/L的18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品。

3）試劑配制：250 mmol/L NaOH溶液、1 mol/L NaAC溶液、0.1 mol/L HAC溶液。

4）檢測(cè)條件：柱溫30 ℃；流速0.25 mL/min；淋洗液A：純水（＞18.2 MΩ），B：250 mmol/L NaOH溶液，C：1 mol/L NaAC溶液，D：0.1 mol/L HAC溶液。

5）洗脫時(shí)間及梯度，見表1。

表1　氨基酸化學(xué)檢測(cè)的洗脫梯度Taabbllee 11 　　EElluuttiioonn ggrraaddiieenntt ffoorr cchheemmiiccaall ddeetteeccttiioonn ooff aammiinnoo aacciiddss

1.3.2.2氨基酸序列分析［27］

采用LTQ XL型色譜-質(zhì)譜檢測(cè)儀器對(duì)組分Ⅱ和組分Ⅲ所含片段的氨基酸序列進(jìn)行檢測(cè)，用LC-MC/MC sequent軟件進(jìn)行分析。

儀器運(yùn)行條件：離子源NSI；離子源溫度260 ℃；毛細(xì)管電壓3.5 kV；脫溶劑氣溫度260 ℃；脫溶劑氣流量20 unit/min；檢測(cè)器電壓200 V。

液相色譜分析條件：流動(dòng)相A：H2O-0.1% TFA；流動(dòng)相B：乙腈-0.1% TFA；流速200 μL/min（分流后調(diào)節(jié)為2 μL/min）；進(jìn)樣量10 μL（冷凍干燥后粉末以5% B液復(fù)溶）；進(jìn)樣方式：自動(dòng)進(jìn)樣；洗脫時(shí)間和梯度：00～20 min時(shí)，B從5%～35%；20～40 min時(shí)，B從35%～95%。

1.3.3氨基酸片段的ACE活性抑制效果檢測(cè)

經(jīng)方法1.3.2.2節(jié)分析檢測(cè)，獲得的短肽片段，采用固相合成法制備，純度大于95%。合成產(chǎn)物由上海楚肽生物科技有限公司制備。

ACE活性抑制效果體外檢測(cè)采用HHL方法［28］，確定水解物主要功效成分。

1.4數(shù)據(jù)處理

氨基酸序列分析采用LC-MC/MC sequent軟件，數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件。

2　　結(jié)果與分析

2.1組分Ⅱ和組分Ⅲ中氨基酸組成分析

按照方法1.3.2.1節(jié)對(duì)水解產(chǎn)物的分離組分Ⅱ和組分Ⅲ的氨基酸組成進(jìn)行分析。由圖1及表2～4可知，對(duì)比18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖譜和出峰時(shí)間，組分Ⅱ包含纈氨酸、絲氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 種氨基酸；對(duì)比18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖譜和出峰時(shí)間，組分Ⅲ包含痕量的絲氨酸和酪氨酸。

圖 1　　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）、組分Ⅱ（B）、組分Ⅲ（C）的洗脫圖譜Fig.1　　Elution profi les of mixed amino acid standards （A） and components Ⅱ （B） and Ⅲ （C）

表2　　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品Table 2　　Retention times of amino acid standards

表3　組分Ⅱ中氨基酸Taabbllee 33 　　RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅱ

表 4　組分Ⅲ中氨基酸Taabbllee 44 　　RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅲ

2.2組分Ⅱ和組分Ⅲ中肽片段氨基酸序列分析

2.2.1組分Ⅱ中片段的氨基酸序列1

圖 2　組分Ⅱ與α1-酪蛋白（AA）　　、αss22-酪蛋白（BB）　　、β-酪蛋白（CC）、κ-酪蛋白（D）的氨基酸序列匹配圖Fig.2　Matching profi les of amino acid sequences between component Ⅱ and α1-casein， αs2-casein， β-casein or κ-casein

表 5 組分Ⅱ與α1-酪蛋白的氨基酸序列匹配數(shù)據(jù)TTaabbllee 55 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd α-caasseeiinn

表6　組分Ⅱ與αss22-酪蛋白的氨基酸序列匹配數(shù)據(jù)TTaabbllee 66 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd αss22-caasseeiinn

表 7 組分Ⅱ與β-酪蛋白的氨基酸序列匹配數(shù)據(jù)TTaabbllee 77 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd β-caasseeiinn

表 8　組分Ⅱ與κ-酪蛋白的氨基酸序列匹配數(shù)據(jù)TTaabbllee 88 　　MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd κ-caasseeiinn

組分Ⅱ在4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）中都有匹配的肽段，結(jié)果見圖2。分析軟件的導(dǎo)出數(shù)據(jù)見表5～8。圖2A中標(biāo)示的深色部分代表了氨基酸序列匹配度為“極可信”，所以在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，只選取深色部分的氨基酸序列。表5是軟件檢測(cè)導(dǎo)出的“極可信”部分的數(shù)據(jù)。其中，“Q6（脫酰胺基）”6號(hào)位置的Q（Gln，谷氨酰胺）有脫氨基現(xiàn)象；“相關(guān)系數(shù)”是搜庫軟件中打分相關(guān)系數(shù)，作為篩選條件參比；“對(duì)比打分”表示搜庫對(duì)比打分；“價(jià)態(tài)”代表帶H的個(gè)數(shù)，有1、2、3價(jià)；“質(zhì)荷比”代表價(jià)態(tài)的分子質(zhì)量；“分子質(zhì)量”表示肽段的分子質(zhì)量。篩選條件：當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于1.9時(shí)，價(jià)態(tài)為1；當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于2.2時(shí)，價(jià)態(tài)為2；當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于3.75時(shí)，價(jià)態(tài)為3；結(jié)果便有極高的可信度。因此，結(jié)合圖2A和表5分析可知，組分Ⅱ在α1-酪蛋白中的匹配的氨基酸序列有3 段，分別是：LGYLEQLLR、FVAPFPEVFGK和YVPLGTQYTDAPSF。綜合分析圖2B和表6可知，組分Ⅱ在α2-酪蛋白中的極可信氨基酸序列是YQKFPQYLQY。綜合分析圖2C和表7，組分Ⅱ在β-酪蛋白中的極可信的氨基酸序列是PVVVPPFLQPEVM。根據(jù)圖2D和表8分析可知，組分Ⅱ在κ-酪蛋白中的極可信匹配的氨基酸序列有2 段，分別為：SRYPSYGLNYYQQKPV 和INNQFLPYPY。

2.2.2組分Ⅲ的氨基酸序列

根據(jù)2.1節(jié)的結(jié)果，可以很明顯得知組分Ⅲ的氨基酸序列有2 種可能，即Ser-Tyr（SY）、Tyr-Ser（YS）。經(jīng)過與4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）的氨基酸組成比對(duì)，最終確定為αs2-f（56～57）∶YS。

綜合MS檢測(cè)結(jié)果，與4 種酪蛋白（α1、α2、β、κ）的氨基酸組成比對(duì)，組分Ⅱ和組分Ⅲ的短肽片段共有8 個(gè)，分別為：從N端，αs1-f（25～35）∶FVAPFPEVFGK，αs 1-f（1 0 3～1 1 1）∶L G Y L E Q L L R，αs 1-f （1 7 8～1 9 0）∶Y V P L G T Q Y T D A P S F，αs 2-f （56～57）∶YS，αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY，β-f（9 0～1 0 2）∶P V V V P P F L Q P E V M，κ-f （3 4～4 9）∶S R Y P S Y G L N Y Y Q Q K P V，κ-f （52～61）∶INNQFLPYPY。

2.3氨基酸片段的ACE活性抑制效果檢測(cè)

將上述8 個(gè)片段采用固相合成法制備，純度大于95%，合成產(chǎn)物由上海楚肽生物科技有限公司制備。ACE活性抑制效果檢測(cè)采用分光光度方（HHL法）進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)研究結(jié)果，這些肽片段對(duì)ACE活性抑制主要是競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此，可根據(jù)其對(duì)ACE活性抑制率的大小及其隨片段質(zhì)量濃度的變化關(guān)系判斷其是否具有ACE活性抑制作用。檢測(cè)結(jié)果見圖3和表9～16。

圖 3 　αss22-f（566～　5577） ∶YS的質(zhì)量濃度（AA）、αss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY質(zhì)量濃度（BB）、κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY的質(zhì)量濃度（C）與AACCEE活性抑制率的關(guān)系曲線Fig.3　Correlation curves between concentrations of αs2-f （56-57）:YS，αs2-f （98-107）， κ-f （52-61） and percentage inhibition of ACE activity

表 99 　　片段αss11-f（255～　3355）∶FVAPFPEVFGK的ACE活性抑制作用Table 9　Inhibitory effect of αss11-ff （2255-35）:FVAPFPEVFGK on ACE activittyy

表 100 　　片段αss11-f（103～111111）∶LGYLEQLLR對(duì)ACE活性的抑制作用Table 10　Inhibitory effect ofαss11-f （110033-111111）∶LGYLEQLLR on ACE activittyy

?表 111 　　片段αss11-f（AC 17 E8活～　性1199的00）抑∶制YV作P用LGTQYTDAAPPSSFF對(duì)Table 11　Inhibitory effect of αss11-f （117788-119900）∶YVPLGTQYTDAPSFF oonn ACE activviittyy

根據(jù)表12的檢測(cè)結(jié)果，將樣品αs2-f（56～57）∶YS質(zhì)量濃度和ACE抑制率進(jìn)行作圖擬合，結(jié)果見圖3A，根據(jù)圖3A擬合的方程計(jì)算片段αs2-f（56～57）∶YS對(duì)ACE抑制的IC50值為11.89 μg/mL。因此，該片段具有很強(qiáng)的ACE活性抑制作用。根據(jù)表13的檢測(cè)結(jié)果，將樣品αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY質(zhì)量濃度和ACE抑制率進(jìn)行作圖擬合，結(jié)果見圖3B，經(jīng)擬合的方程計(jì)算片段αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY對(duì)ACE抑制的IC50值為11.75 μg/mL。因此，該片段具有很強(qiáng)的ACE活性抑制作用。根據(jù)表16檢測(cè)結(jié)果，將樣品κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY質(zhì)量濃度和ACE抑制率進(jìn)行作圖擬合，結(jié)果見圖3C，經(jīng)擬合的方程計(jì)算片段κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY對(duì)ACE抑制的IC50值為421 μg/mL。與水解物的超濾透出物相比（IC50= 250 μg/mL），該值較大，可能不是主要ACE抑制肽。

表 122 　 片段αss22-f（566～　5577） ∶YS對(duì)ACE活性的抑制作用Table 12　Inhibitory effect of αss22-ff （5566-5577）∶YS on ACE actiivityy

表 133 　 片段αss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY對(duì)ACE活性抑制作用Table 13　Inhibitory effect ofαss22-ff （9988-110077）∶YQKFPQYLQY on ACE activittyy

表 144 　　片段β-f（90～110022）∶PVVVPPFLQPEVM對(duì)ACE活性抑制作用Table 14　Inhibitory effect ofβ-ff （9900-110022）∶PVVVPPFLQPEVMM oonn ACE a　ctivviittyy

表 155 　 片段κ-f（344～4499）∶SRYPSYGLNYYQQQQKKPPVV對(duì)ACE活性抑制作用Table 15　Inhibitory effect of κ-ff （3344-4499）∶SRYPSYGLNYYQQKKPPVV，on ACE activiittyy

表 166 　　片段κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY對(duì)ACE活性抑制作用Table 16　Inhibitory effect of κ-ff （5522-6611）∶INNQFLPYPY on ACE activittyy

因此，根據(jù)上述ACE活性抑制效果檢測(cè)，在所獲得的8 個(gè)片段中，有3 個(gè)具有ACE活性抑制作用，其中αs2-f （56～57）∶YS和αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY具有很強(qiáng)的ACE活性抑制效果。

3　　討 論

酪蛋白是牛乳中含量最高，種類最多的蛋白質(zhì)，在其母蛋白中，含有多種生物活性片段，目前，研究人員已從酪蛋白，經(jīng)不同的蛋白酶或微生物的水解液中分離出多種活性片段，包括抗菌肽［29-31］、促鈣吸收肽［32］、降血壓肽等，其中，研究人員利用不同蛋白酶水解或微生物發(fā)酵，從牛乳酪蛋白中分離獲得了多個(gè)降壓肽片段（表17）。這些片段，由于所用酶或微生物的不同，其片段的氨基酸組成不同，其組成規(guī)律也不完全符合Ile-Lys-Pro （IKP）、Ile-Glu-Pro（IEP）和Ile-Lys-Tyr（IKY）［41］的氨基酸結(jié)構(gòu)組成。本研究模擬人體消化系統(tǒng)，先經(jīng)胃蛋白酶水解，再經(jīng)胰蛋白酶水解酪蛋白，獲得的具有ACE活性抑制肽，αs2-f（56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY 和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY，在食用過程中，不會(huì)受胃腸系統(tǒng)蛋白酶的影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，功能穩(wěn)定。另外，其氨基酸組成，特別是αs2-f（56～57）∶YS，不符合文獻(xiàn)［41］規(guī)律，但具有很好的ACE抑制活性。根據(jù)目前的研究，源于蛋白質(zhì)水解物的肽片段與ACE之間的相互作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，肽與ACE嵌合的袋狀部位可分為S1、S2和S1'，其中S1袋狀部位由Ala 354、Glu 384和Tyr 523殘基組成；S2袋狀部位由Gln 281、His 353、Lys 511、His 513和Tyr 520殘基組成；S1'含有Glu 162殘基［42-43］。另外，不同來源的ACE抑制物與ACE嵌合作用的部位不同［44］。對(duì)于所獲得的3 個(gè)片段，與ACE如何進(jìn)行作用，還需要進(jìn)一步研究。

表 17 源于牛乳酪蛋白的ACE抑制肽TTaabbllee 1177 　　AACCEE iinnhhiibbiittiioonn ppeeppttiiddee ffrroomm bboovviinnee ccaasseeiinn

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Separation of ACE Inhibitory Peptides from Casein Hydrolysate and Analysis of Their Amino Acid Sequences

HU Zhihe1，2， XIA Lei1， SUN Zhengang3， WU Wenqi3， FENG Yongqiang3， XUE Lu1，2， LIU Xujin1， JIA Ying1
（1. College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China；
2. Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology， Tianjin300134， China；3. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd.， Tianjin300402， China）

The objectives of this study were to separate angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory peptides from casein hydrolysate produced by sequential hydrolysis of casein with pepsin followed by trypsin and to analyze their amino acid sequences. The hydrolysate was concentrated by ultrafiltration and separated by Sephadex G-15 column chromatography into three components. Components Ⅱ and Ⅲ， which had higher inhibitory effect on ACE activity， were collected. Ion chromatography was used to analyze amino acid composition of fragments from the two components. LCMS/MS was used to analyze amino acid sequence of fragments， solid-phase synthesis was used to synthetize short-chain peptides， and a spectrophotometric method was used to test the inhibitory effect of hydrolysate on ACE activity. Results showed that component Ⅱ contained eight amino acids including valine， serine， proline， leucine， phenylalanine， glutamatic acid， asparaginic acid， and tyrosine； while component Ⅲ contained trace amounts of serine and tyrosine. Eight fragments were obtained from both components by LC-MC/MC analysis， including three ACE inhibitory fragments αs2-f （56-57）:YS，αs2-f （98-107）:YQKFPQYLQY and κ-f （52-61）:INNQFLPYPY with half maximal inhibitory concentration （IC50） of 11.89，11.75 and 421 μg/mL， respectively.

bovine casein； pepsin； trypsin； angiotensin converting enzyme （ACE）； inhibitory peptide

TS252.42

A

1002-6630（2015）24-0156-08

10. 7506/spkx1002-6630-201524028

2015-06-28

天津市科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDNC00017）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5049）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC34500）；天津市北辰區(qū)科技計(jì)劃補(bǔ)助項(xiàng)目（2014-CXYH-KF-001）

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)閷Ｓ霉δ苁称?。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn