饒勝其，臧祥玉，濮瑜雯，楊振泉，方維明（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州　225127）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化廣昌白蓮蛋白提取工藝及其酶解多肽抗氧化活性

饒勝其，臧祥玉，濮瑜雯，楊振泉，方維明*
（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225127）

以廣昌白蓮為原料，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取白蓮蛋白的工藝，并采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)白蓮蛋白進(jìn)行單酶和有次序雙酶水解，研究其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。結(jié)果表明，廣昌白蓮蛋白的最佳提取條件為：在超聲功率固定250 W條件下，料液比1∶14（g/mL）、提取溫度35.5 ℃、提取時(shí)間58 min、NaCl濃度0.14 mol/L。所得蛋白提取率達(dá)到89.86%，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacryl amide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析顯示其分子質(zhì)量主要分布在14～25 kD和35～60 kD之間；不同酶解方式顯著影響了白蓮蛋白的酶解效果及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，其中先胃蛋白酶后堿性蛋白酶的雙酶酶解為最佳方式，其蛋白水解度達(dá)到20%，其酶解產(chǎn)物（P-A）H的總還原能力（A700 nm）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和·OH清除能力IC50值分別達(dá)到1.002、0.379 mg/mL和1.093 mg/mL，表明廣昌白蓮蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

廣昌白蓮；提?。幻附?；抗氧化活性

蓮子是一種水生經(jīng)濟(jì)作物，在中國(guó)種植的歷史已經(jīng)有3 000多年［1］。目前，蓮花在亞洲、大洋洲、美洲被廣泛種植和消費(fèi)［2］。傳統(tǒng)上，蓮子被用作可食性的蔬菜和草藥［3］。有報(bào)道稱，蓮子具有豐富功能性化合物，包括糖類、多酚類、黃酮醇類、花青素類、生物堿類等。這些生物活性物質(zhì)都具備藥理活性，比如抗肥胖、抗癌、消炎及心血管疾病等［4-5］。通過對(duì)廣昌白蓮干白蓮蓮子中蛋白的組成、溶性和品質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其蛋白含量為23.94%，其氨基酸組成中必需氨基酸的比例符合世界衛(wèi)生組織規(guī)定的要求，鹽溶和水溶性蛋白占總蛋白量的76.23%，醇溶蛋白僅占0.33%［6］。

目前，對(duì)廣昌白蓮的研究?jī)H限于加工、選育、成分分析等［7］，對(duì)其功能成分的研究多集中于蓮子多酚［8］、蓮子多糖［9］等，對(duì)蛋白研究則局限于蓮子蛋白的優(yōu)化提?。?0］、氨基酸種類［11］，而對(duì)蛋白降解后新功能的報(bào)道極少。張羽［12］對(duì)蓮子蛋白的組成及其分子特性進(jìn)行了研究，運(yùn)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）、等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）電泳分析得到蓮子水溶蛋白的10 個(gè)亞基分子質(zhì)量分布在69.4～87 kD之間；鹽溶蛋白10 個(gè)亞基分子質(zhì)量分布在14.2～110 kD之間；酸溶蛋白的12 個(gè)亞基分子質(zhì)量分布在7.2～97.3 kD之間；堿溶蛋白6 個(gè)亞基分子質(zhì)量分布在15.0～46 kD之間；并且研究發(fā)現(xiàn)蓮子的4 種主要蛋白組分對(duì)·OH具有較好的清除作用。這說明蓮子蛋白分子中存在著具有抗氧化能力的氨基酸片段，可以通過酶解的方式對(duì)蓮子蛋白進(jìn)行水解，釋放出蓮子蛋白中具有抗氧化性能的多肽片段，增強(qiáng)蓮子蛋白的功能特性。

目前有關(guān)抗氧化肽的研究主要集中在抗氧化肽的酶解制備、分離、鑒定以及酶解產(chǎn)物或抗氧化肽的體內(nèi)外生物活性研究。盡管部分高純抗氧化肽被證實(shí)具有強(qiáng)效的抗氧化活性，但其分離純化過程一般較繁瑣，成本較高。相對(duì)于純肽，高活性蛋白水解母液或粗分離組分從產(chǎn)品開發(fā)方面更具有可行性［13］。本研究以江西省廣昌白蓮為原料，對(duì)蓮子蛋白的提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行了優(yōu)化，得到了高含量的蓮子蛋白，并對(duì)所提取的蓮子蛋白分別用胃蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行了單酶和雙酶復(fù)合水解，對(duì)其水解產(chǎn)物的抗氧化能力進(jìn)行了考察，為高抗氧化活性蛋白酶解液產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

廣昌白蓮鷹潭市龍虎山百佳食品有限公司；堿性蛋白酶（＞10萬 U/g）上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、鄰苯二甲醛（O-phthaldialdehyde，OPA）生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、水楊酸、過氧化氫、鐵氰化鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-7504紫外-可見分光光度計(jì)上海欣茂儀器有限公司；pico17微量臺(tái)式離心機(jī)美國(guó)Thermo公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；KQ-400KDE超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；高速萬能粉碎機(jī)天津四泰斯特儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋國(guó)華儀器有限公司；凍干機(jī)美國(guó)Thermo公司。

1.3方法

1.3.1廣昌白蓮蛋白的提取

參考王亞舉等［14］的方法，并做適當(dāng)調(diào)整：首先將市售白蓮于37 ℃干燥10 h，粉碎，過60目金屬篩，制成蓮子粉。稱取適量的蓮子粉，按一定料液比在一定溫度條件下超聲（固定超聲功率250 W）提取一定時(shí)間后，8 000 r/min離心15 min，收集上清液，測(cè)定蛋白含量并計(jì)算提取率。在最優(yōu)蛋白提取工藝條件下，放大蛋白提取體系至1 L，調(diào)節(jié)上清液pH值至蓮子蛋白等電點(diǎn)，靜止0.5 h，4 000 r/min離心15 min，取沉淀物用95%乙醇溶液洗2 次，蒸餾水洗至中性，冷凍干燥備用。按下式計(jì)算提取率。

1.3.2蛋白提取條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選定料液比、提取時(shí)間、提取溫度、NaCl濃度4 個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)提取效果的影響，選取最優(yōu)單因素條件。

1.3.3蛋白提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Export 8.0的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，每個(gè)組合重復(fù)3 次，因素和水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface methodology

1.3.4蛋白酶解液的制備

水解條件參考饒勝其等［15］的研究，稍作修改，水解步驟如下：取2 g蓮子蛋白粉，加適量緩沖溶液攪拌至蛋白溶解，沸水浴10 min使蛋白變性利于后期酶解，降溫到所需溫度，分別采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行單酶水解以及采用胃蛋白酶與堿性蛋白酶按不同順序進(jìn)行分步水解，反應(yīng)體系為100 mL，水解條件按表2方式進(jìn)行。待酶解反應(yīng)完畢后，95 ℃保溫10 min以終止酶反應(yīng)。整個(gè)酶解過程在酶反應(yīng)器中進(jìn)行，且通過酸堿滴定控制pH值。將所有最終水解液的pH值調(diào)節(jié)至7.5，并于4 ℃、8 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心15 min，收集上清液，－20 ℃凍存，以待分析。

表2　單酶及雙酶分步酶解條件Table 2 The conditions for single and dual enzymatic hydrolysis

1.3.5蛋白含量測(cè)定

廣昌白蓮總蛋白含量的測(cè)定采用常量凱氏定氮法，參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白的測(cè)定》。廣昌白蓮提取液蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.004 4X+0.228 7，R2=0.987 3。蛋白提取效果采用12% SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.3.6蛋白酶解液分析

水解度采用甲醛滴定法［16］進(jìn)行測(cè)定；多肽質(zhì)量濃度采用OPA法［17］進(jìn)行測(cè)定，以胰蛋白胨為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.408X+0.141 1，R2=0.978 9；總還原能力采用Fe3+還原法［18］測(cè)定，樣品多肽質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至0.2 mg/mL，以A700 nm值表示總還原力；DPPH自由基清除活性參考Shimada等［19］的方法測(cè)定，以IC50值表示，即清除50% DPPH自由基時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度；·OH清除活性參考Guo Zhanyong等［20］的方法測(cè)定，以IC50值表示，即清除50%·OH時(shí)所對(duì)應(yīng)的多肽質(zhì)量濃度。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan's多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1廣昌白蓮蛋白提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)蛋白提取率的影響

NaCl溶液濃度0.2 mol/L，在35 ℃條件下分別以料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20對(duì)蓮子蛋白超聲提取60 min，離心取上清液測(cè)定蛋白含量。由圖1可知，蓮子蛋白提取率隨著溶劑用量的增大呈先急劇升高后緩慢下降的趨勢(shì)，在料液比1∶12時(shí)達(dá)到最高，故采用料液比1∶12進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖 1　料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of lotus seed protein

2.1.2提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

圖 2　提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2　Effect of extraction time on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、NaCl溶液濃度0.2 mol/L，在35℃條件下分別超聲波提取15、30、45、60、90、120 min，離心取上清液測(cè)定蛋白含量。由圖2可知，在15～30 min蓮子蛋白提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)迅速上升，在30～60 min基本趨于穩(wěn)定，在45 min時(shí)達(dá)到最大值，但在超過60 min后提取率逐漸下降，可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致部分蛋白變性沉淀，故選用提取時(shí)間45 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

圖 3　提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、NaCl溶液濃度0.2 mol/L，分別在25、30、35、40、45 ℃條件下超聲波提取45 min，離心取上清液測(cè)定蛋白含量。由圖3可知，蓮子蛋白提取率隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，在35 ℃時(shí)達(dá)到最高，35 ℃之后隨著溫度的升高提取率反而下降，其原因可能是溫度過高引起蛋白變性，溶解性減弱，故選用提取溫度35 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4NaCl濃度對(duì)蛋白提取率的影響

圖 4　NaCl濃度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4　Effect of NaCl concentration on the extraction yield of lotus seed protein

固定料液比1∶12、提取時(shí)間45 min，在35 ℃條件下分別以0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L NaCl溶液對(duì)蓮子蛋白進(jìn)行超聲波提取，離心取上清液測(cè)定蛋白含量。由圖4可知，蓮子蛋白提取率隨著鹽濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，在0.15 mol/L時(shí)達(dá)到最高，這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊柠}溶液中鹽溶作用促進(jìn)了蛋白的溶解，而高濃度鹽溶液中鹽析作用降低了蛋白溶解度，故選用濃度為0.15 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行蛋白的提取。

2.2廣昌白蓮蛋白提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　響應(yīng)面優(yōu)化蓮子蛋白提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of lotus seed protein

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度、NaCl濃度為自變量，蛋白提取率Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

2.2.2模型建立及顯著性分析

應(yīng)用Box-Behnken對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表4及模擬多元響應(yīng)面回歸模型，得出的方程為：

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Analysis of variance of regression model

由表4得出，模型的P＜0.01，模型達(dá)到極顯著。模型失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際誤差值較小，可以用此模型來預(yù)測(cè)真實(shí)值。模型的的絕對(duì)系數(shù)R2=0.993 1，說明該模型能解釋99.31%的響應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，與實(shí)際情況吻合，可以用此模型對(duì)蛋白提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。各因素的影響大小為提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞NaCl濃度，所有二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4對(duì)蛋白提取率有顯著影響。

2.2.3蛋白提取工藝的響應(yīng)面分析

圖 5　各因素交互作用對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface contour plots showing the interactive effects of various factors on the extraction yield of lotus seed protein

由圖5A可知，隨著料液比和提取時(shí)間水平的增加，響應(yīng)值均先增加后減小，在中心點(diǎn)附近提取率最高；由圖5B可知，隨著料液比和提取溫度水平的增加，響應(yīng)值先增加后減小，在中心點(diǎn)有最大提取率；由圖5C可知，隨著料液比和NaCl濃度水平的增加，響應(yīng)值不斷增加，超過中心點(diǎn)后逐漸趨于穩(wěn)定；由圖5D可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)值增大，超過中心點(diǎn)后，趨于穩(wěn)定，而隨著提取溫度的升高，提取率先增加后減小；由圖5E可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)值不斷增加，超過中心點(diǎn)，趨于穩(wěn)定，隨著NaCl濃度增加，響應(yīng)值先增加后減??；由圖5F可知，隨著提取溫度和NaCl濃度水平的增加，響應(yīng)值均先增加后減小，在中心點(diǎn)有最大提取率。由以上分析可知，在各因素中心點(diǎn)附近，蛋白具有最高提取率，回歸方程具有最優(yōu)水平。

2.2.4最佳提取條件的確定和驗(yàn)證

將回歸方程對(duì)X1、X2、X3、X4分別取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，解方程組得出最優(yōu)提取條件為料液比1∶14.12、提取溫度35.64 ℃、提取時(shí)間57.71 min、NaCl濃度0.14 mol/L，計(jì)算蛋白提取率為91.74%，但從實(shí)驗(yàn)的可行性考慮，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比1∶14、提取溫度35.5 ℃、提取時(shí)間58 min、NaCl濃度0.14 mol/L。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，所得蛋白提取率為89.86%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型理論值非常接近，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)相對(duì)偏差不超過5%。

2.3廣昌白蓮蛋白的酶解液分析

抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系研究表明，肽段內(nèi)部和末端的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸能顯著增強(qiáng)抗氧化肽的活性。例如，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、His、Tyr、Trp和Cys等氨基酸。疏水性氨基酸（如Ala、Val、Leu）的脂肪烴側(cè)鏈能使抗氧化肽與多不飽和脂肪酸的相互作用增強(qiáng)，或使其易于與自由基結(jié)合，從而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［21］。芳香族氨基酸Trp、Tyr可通過供氫發(fā)揮抗氧化作用［22］。據(jù)報(bào)道，胃蛋白酶和堿性蛋白酶作用蛋白底物均易于產(chǎn)生末端為疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的肽段［23-25］。許多研究也證實(shí)胃蛋白酶和堿性蛋白酶及其復(fù)合作用對(duì)蛋白原料中的高活性功能肽的釋放具有顯著效果［15，26-28］。因此，本研究選用胃蛋白酶和堿性蛋白酶分別對(duì)蓮子蛋白分別進(jìn)行單酶和有次序雙酶酶解，并考察所致蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。

2.3.1不同酶解方式對(duì)蛋白水解度的影響

圖 6　蛋白水解度（A）和蛋白水解效果的電泳分析（BB）Fig.6　Hydrolysis degree （A） and SDS-PAGE analysis of the effectiveness of enzymatic hydrolysis （B） of lotus seed protein

由圖6A可知，雙酶分步水解作用下蓮子蛋白的水解度顯著高于單酶作用；雙酶水解的先后順序也顯著影響了蓮子蛋白水解度；在4 種不同的水解液中，胃蛋白酶-堿性蛋白酶作用下蓮子蛋白的水解度顯著高于其他三者。其原因是，所用堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶作用位點(diǎn)不同，對(duì)底物蛋白的水解能夠互為補(bǔ)充，故雙酶酶解效果高于單酶；在雙酶酶解中，第一步酶解產(chǎn)生的肽段及未水解完全的蛋白即成為第二步酶解的底物，而蓮子中的不同種類蛋白對(duì)兩種蛋白酶的敏感程度有差異，故水解次序肯定會(huì)影響最終產(chǎn)物的肽段組成。圖6B電泳結(jié)果顯示，在最優(yōu)提取工藝條件下，所提粗蛋白溶液及其酸沉凍干后的蛋白粉的蛋白分子質(zhì)量分布與蓮子原料中的蛋白基本保持一致，主要在14～25 kD和35～60 kD范圍內(nèi)（泳道1～3）；基于蓮子凍干蛋白粉的蛋白含量檢測(cè)結(jié)果，換算得出該提取蛋白樣品中的蛋白純度達(dá)到92%，表明該提取工藝優(yōu)良。胃蛋白酶水解液PH中依然保留有高含量的較高分子質(zhì)量蛋白（約10～30 kD），進(jìn)一步佐證了其作用下蓮子蛋白的低度水解，水解度僅為7.78%；雙酶酶解液中的高分子蛋白條帶數(shù)量及比例顯著低于單酶酶解液，許多研究報(bào)道顯示高活性抗氧化肽的分子質(zhì)量一般低于3 kD，因此，本研究中從蛋白利用率及抗氧化肽分子質(zhì)量層面考慮，應(yīng)該選用雙酶對(duì)蓮子蛋白進(jìn)行酶解。

2.3.2廣昌白蓮蛋白酶解液的抗氧化活性

圖 7　蓮子蛋白酶解液的總還原力（A）、DPPH自由基清除活性（BB）和·OH清除活性（CC）Fig.7　Total reducing power （A）， DPPH radical scavenging activity （B） and hydroxyl radical scavenging activity （C） of lotus seed protein hydrolysate

由圖7可知，當(dāng)酶解液質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，4 種水解液的還原能力在0.65～1.02之間，大小順序?yàn)椋≒-A）H＞（A-P）H＞AH＞PH，其中水解液PH的還原能力顯著弱于其他3 種水解液（圖7A）；4 種水解液的DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)椋ˋ-P）H＞PH＞（P-A）H＞AH，其中水解液PH和（A-P）H較強(qiáng)，其IC50值分別為0.162 mg/mL和0.146 mg/mL（圖7B）；4 種水解液的·OH清除能力大小順序?yàn)椋≒-A）H＞AH＞（A-P）H＞PH，其中水解液AH和（P-A）H顯著高于其他兩種水解液，其IC50值分別達(dá)到1.396 mg/mL和1.093 mg/mL（圖7C）。綜合圖7可知，蓮子蛋白的4 種酶解液的總還原能力、DPPH自由基清除活性和·OH清除活性并沒有呈現(xiàn)嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，原因是所選3 種抗氧化指標(biāo)的反應(yīng)原理不同，所反映的抗氧化活性與酶解液中的肽段組成具有重要關(guān)系。盡管如此，在蓮子蛋白的4 種酶解液中，酶解液（P-A）H的總還原能力和·OH清除能力最強(qiáng)，且其DPPH自由基清除活性也處于中等水平。此外，4 種酶解方式中，先胃蛋白酶后堿性蛋白酶作用下蓮子蛋白的水解度顯著高于其他三者，達(dá)到20%（圖6A），表明這種酶解方式對(duì)蓮子蛋白的利用率最高。綜上所述，選用胃蛋白酶和堿性蛋白酶依次分步酶解作為蓮子蛋白抗氧化肽制備的最佳用酶及酶解方式。

33　結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化，確定廣昌白蓮蛋白最佳提取條件為：在超聲功率固定250 W條件下，料液比1∶14（g/mL）、提取溫度35.5 ℃、提取時(shí)間58 min、

NaCl濃度0.14 mol/L。所得蛋白提取率達(dá)到89.86%；所提蛋白分子質(zhì)量分布與蓮子原料中的蛋白基本保持一致，主要在14～25 kD和35～60 kD范圍內(nèi)；蛋白提取影響因素大小為：提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞NaCl濃度。經(jīng)過熱變性處理的蓮子提純蛋白，分別采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)蛋白進(jìn)行單酶和有次序的雙酶酶解，結(jié)果表明：先胃蛋白酶后堿性蛋白酶處理?xiàng)l件下的蓮子蛋白酶解產(chǎn)物（P-A）H具有最高水解度和較高抗氧化活性，其水解度達(dá)到20%，其總還原能力（A700 nm）、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的IC50值分別達(dá)到1.002、0.379 mg/mL和1.093 mg/mL。

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Optimization of Extraction Conditions of Guangchang White Lotus Seed Protein by Response Surface Methodology and Antioxidant Activities of Its Enzymatic Hydrolysates

RAO Shengqi， ZANG Xiangyu， PU Yuwen， YANG Zhenquan， FANG Weiming*
（School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou2 25127， China）

The conditions for ultrasonic-assisted extraction of protein from Guangchang while lotus seed were optimized by single factor experiments and response surface methodology. The extracted proteins were hydrolyzed using alcalase and pepsi singly or in sequential combinations， and antioxidant activities of the resulting hydrolysates were analyzed. The results suggested that the optimum conditions under a fi xed ultrasonic power of 250 W for extracting protein from Guangchang white lotus seed were determined as follows: solid/solvent ratio， 1:14； extraction temperature， 35.5 ℃； extraction time，58 min； and NaCl concentration， 0.14 mol/L. Under these conditions， the extraction yield of protein was 89.86%. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed that molecular weights of the extracted proteins were mainly in the range of 14-25 kD and 35-60 kD. Different treatments with pepsin and/or alcalase signifi cantly infl uenced the effectiveness of enzymatic hydrolysis of lotus seed protein and antioxidant activities of hydrolysates， and sequential treatment with pepsin followed by alcalase was the best one. Under this treatment， the degree of hydrolysis was 20%， and the total reduce power （A700 nm）， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical scavenging activity （IC50）and hydroxyl radical scavenging activity （IC50） of the hydrolysate （P-A）H were 1.002， 0.379 mg/mL and 1.093 mg/mL，respectively， demonstrating that the enzymatic hydrolysate had potent antioxidant activity.

Guangchang white lotus； extraction； enzymat ic hydrolysis； antioxidant activity

TS262.5

A

1002-6630（2015）24-0063-07

10.7506/spkx1002-6630-201524011

2015-06-30

江蘇省自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（B K20140479）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（12KJD550007；15KJA550004）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

饒勝其（1981—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及食品資源綜合利用。E-mail：sqrao@yzu.edu.cn

方維明（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工及食品生物技術(shù)。E-mail：wmfang@yzu.edu.cn