周沖，劉學(xué)良，鄭曉梅，劉亮（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 .神經(jīng)外科，.神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ的構(gòu)建及在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)*

周沖1，劉學(xué)良1，鄭曉梅2，劉亮1
（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.神經(jīng)外科，2.神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的體外構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ，轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并檢測(cè)其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。方法通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率，并通過(guò)Real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法、Western blot法檢測(cè)載脂蛋白-J（apoJ）的表達(dá)。結(jié)果增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)35%。轉(zhuǎn)染后Real-time PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)證實(shí)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)論重組質(zhì)粒pEGFPN1-apoJ成功轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中得到表達(dá)，有助于應(yīng)用apoJ行基因治療，為進(jìn)一步研究apoJ作為新的腦出血治療措施奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

載脂蛋白-J（apoJ）；重組質(zhì)粒；基因轉(zhuǎn)染；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

載脂蛋白-J（apolipoprotein J，apoJ，又稱clusterin）是一種幾乎所有類型的細(xì)胞都能分泌的多功能糖蛋白。在血漿中apoJ與高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）相關(guān)，尤其與含有ApoAI和膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白活性的HDL亞型聯(lián)系最密切。在損傷組織中，apoJ基因表達(dá)升高，是一種退化或損傷組織中基因轉(zhuǎn)錄上行調(diào)節(jié)的蛋白，參與組織損傷的修復(fù)。相關(guān)研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)介入腦出血后的神經(jīng)元死亡，而apoJ作為一個(gè)明確的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制腦出血后的補(bǔ)體激活阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，使apoJ作為新的腦出血的治療措施成為可能。本研究旨在建立apoJ基因的體外真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究高表達(dá)apoJ基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血疾病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)（SD）大鼠，體重80～100 g，由四川醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

試劑：α-MEM培養(yǎng)基；胎牛血清（Gibco公司），脂質(zhì)體LipofectaminTM2000（Invitrogen公司），兔抗鼠apoJ抗體（Bioworld Technology公司），正反向引物（上海生物工程有限公司），總RNA提取試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solaria公司），兔抗鼠apoJ抗體（Proteintech公司），Anti-GAPDH，二抗-羊抗兔IgG（Bios公司），10～170 kD電泳蛋白彩色預(yù)Marker（Thermo公司），ECL發(fā)光液（Millipore公司），重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ和空質(zhì)粒pEGFP-N1由上海生工完成并提供。

1.2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，采用貼壁培養(yǎng)法。

1.3脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ和空質(zhì)粒pEGFP-N1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

胰蛋白酶消化第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5～6×106接種于6孔板中，細(xì)胞接種到6孔板融合達(dá)90%以上時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1天換液。轉(zhuǎn)染前將6孔板中的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗2遍，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為A組、B組和C組，A組為實(shí)驗(yàn)組，用質(zhì)脂體LipofectamineTM2000進(jìn)行pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染；B組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1；C組為空白對(duì)照組，加入等量質(zhì)脂體，其他步驟均相同。各組所用脂質(zhì)體量相等，A組所用重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ的量與B組所用空質(zhì)粒pEGFP-N1的量相等。轉(zhuǎn)染后在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，6 h后更換含有血清無(wú)雙抗的全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，并利用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定轉(zhuǎn)染后1 d、2 d、3 d和5 d時(shí)的表達(dá)效率。

1.4重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)

采用Real-time PCR法檢測(cè)重組質(zhì)粒pEGFPN1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，轉(zhuǎn)染72 h后，分別收集A組、B組和C組細(xì)胞，一步法提取各組細(xì)胞總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄，用先前設(shè)計(jì)的正反向引物（見附表），通過(guò)Real-time PCR法檢測(cè)apoJ基因的表達(dá)，并行各組PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分析。Real-time PCR條件為：Stage 1：預(yù)變性95℃、30 s，1個(gè)循環(huán)，Stage 2：PCR反應(yīng)95℃、5 s，58℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)。

附表　apoJ及GAPDH mRNA的引物序列

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后，取出3組細(xì)胞爬片。經(jīng)4%多聚甲醛固定，用3%過(guò)氧化氫處理，滴加5%BSA，37℃孵育20 min，去血清，滴加兔抗鼠apoJ抗體（1∶100），4℃過(guò)夜。加二抗，37℃孵育30 min；上述各操作步驟之間均用PBS振蕩洗滌。最后用DAB顯色，常規(guī)脫水、封片，顯微鏡下觀察。

1.6利用Western blot法檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后，分別收集3組細(xì)胞，行貼壁細(xì)胞蛋白提取。利用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)，制膠，上樣行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵兔抗鼠apoJ一抗（1∶1 000）4℃過(guò)夜，孵山羊抗兔二抗1 h，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。

2　結(jié)果

2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未貼壁時(shí)為圓形單核細(xì)胞，折光性強(qiáng)。12～24 h后開始貼壁，貼壁后形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)槎嘟切魏捅馄叫巍Ｅ囵B(yǎng)10～14 d培養(yǎng)板孔內(nèi)即可達(dá)90%融合，形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形為主（見圖1）。第5～6代后細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定相同，擠壓成束狀，漩渦狀，細(xì)胞胞漿豐富，核大，核仁也較明顯。

2.2脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染24 h后，由于脂質(zhì)體本身的細(xì)胞毒性，造成3組細(xì)胞均出現(xiàn)少量呈懸浮狀的絮狀物，經(jīng)換液去除這些死細(xì)胞后未再發(fā)生上述現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察，A組和B組均有較多的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，C組細(xì)胞未見熒光。綠色熒光多見于折光性強(qiáng)、處于分裂期的細(xì)胞；綠色熒光強(qiáng)弱不均，提示基因轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)略有差異。至轉(zhuǎn)染后72 h綠色熒光最明顯（見圖2），以后無(wú)明顯改變，5 d以后綠色熒光呈逐漸下降趨勢(shì)。利用流式細(xì)胞儀測(cè)定EGFP在第1、2、3、5天對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為28.60%、31.67%、34.62%和15.32%。

2.3重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后，經(jīng)Real-time PCR擴(kuò)增后，3組細(xì)胞均有不同程度的apoJ mRNA表達(dá)，但A組細(xì)胞apoJ mRNA表達(dá)量明顯高于其他兩組，提示A組細(xì)胞除細(xì)胞本身內(nèi)源性apoJ基因表達(dá)外，同時(shí)存在pEGFP-N1-apoJ攜帶的外源性目的基因apoJ表達(dá)（見圖3）。Real-time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，A組、B組和C組細(xì)胞均在129 bp處有一特異性擴(kuò)增條帶，提示均有apoJ基因轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用Ea-gle EyeⅡ型圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)電泳帶進(jìn)行掃描，根據(jù)各條帶光密度值，計(jì)算各組apoJ mRNA表達(dá)的相對(duì)水平，結(jié)果提示A組細(xì)胞apoJ mRNA表達(dá)水平明顯高于其他兩組（見圖4）。

2.4轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后，3組細(xì)胞爬片經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)，A組陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于其他兩組。提示A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性目的基因apoJ后，外源性目的基因apoJ得到高效的轉(zhuǎn)錄和翻譯（見圖5）。

2.5轉(zhuǎn)染后 3組細(xì)胞經(jīng) Western blot法檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h后，3組細(xì)胞利用Western blot進(jìn)行檢測(cè)apoJ蛋白的表達(dá)，A組細(xì)胞可見apoJ蛋白大量表達(dá)，B、C組細(xì)胞見apoJ蛋白微量表達(dá)，利用quantity one軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，結(jié)果表明A組細(xì)胞apoJ蛋白表達(dá)量明顯高于B、C組細(xì)胞。提示A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性目的基因apoJ后，外源性目的基因apoJ得到高效的轉(zhuǎn)錄和翻譯（見圖6）。

圖1　MSCs原代培養(yǎng)10～14 d（×100）

圖2　轉(zhuǎn)染72 h時(shí)熒光顯微鏡觀察 （×100）

圖3　轉(zhuǎn)染72 h時(shí) Real-time PCR

圖4　轉(zhuǎn)染72 h時(shí)Real-time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖5MSCs轉(zhuǎn)染p-EGFP-N1-apoJ 72 h細(xì)胞免疫組織化學(xué) （×400）

圖6　Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h時(shí)apoJ的表達(dá)

3　討論

apoJ是一種雜二聚體糖蛋白，由兩個(gè)亞單位α 和β鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量為70 000。廣泛分布于各種組織和體液中［1-3］，人apoJ mRNA在腦組織中濃度最高，依次分別為睪丸、卵巢、肝、心和肺，在脾、乳腺和膀胱中含量最少。apoJ在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有高表達(dá)［4］，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益受到重視。相關(guān)研究表明［5-6］，apoJ具有抑制細(xì)胞凋亡、參與補(bǔ)體調(diào)節(jié)抑制炎癥反應(yīng)、參與脂質(zhì)代謝等多種生理功能。補(bǔ)體激活引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用日益受到重視［7］，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是腦出血疾病重要的病理生理機(jī)制，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡成為治療腦出血的新方法［8］。有關(guān)apoJ保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的具體機(jī)制目前尚未明確，CALERO等［9］的研究表明：腦損傷后apoJ濃度上調(diào)是對(duì)神經(jīng)元的一種保護(hù)反應(yīng)，主要有4種機(jī)制：①apoJ可作為反凋亡信號(hào)；②抑制補(bǔ)體形成膜攻擊復(fù)合物，從而抑制炎癥；③apoJ具有抗氧化作用；④和部分炎癥相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制這些蛋白導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。apoJ與阿爾茨海默病、前列腺癌和乳腺癌的相關(guān)研究報(bào)道較多，而與腦血管疾病的研究報(bào)道不多。相關(guān)研究表明，apoJ還具有促進(jìn)神經(jīng)元分化和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元的作用［10］，亦有利于神經(jīng)元的可塑性［11］。

MSCs最早是由FRIEDENSTEIN等［12］從骨髓中分離培養(yǎng)出來(lái)，是一種具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，在特定環(huán)境下可分化為所在組織的表型細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為多種細(xì)胞，如骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［13-14］。KOPEN等［15］首次報(bào)道將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入新生鼠側(cè)腦室可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。有關(guān)研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為特定類型和有功能的神經(jīng)元［16-18］，并且通過(guò)獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制完成向神經(jīng)元分化［19］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有類似神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能，但又有其他干細(xì)胞沒(méi)有的特性，使其成為干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的理想細(xì)胞供體和轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞載體［20-22］。干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，使損傷軸突再生、突觸重建和恢復(fù)部分功能成為可能，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞除了具有干細(xì)胞的一般特性外，還具有取材方便、不涉及倫理問(wèn)題、易于外源基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)、免疫原性弱、可進(jìn)行自體移植等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種細(xì)胞替代治療及基因治療的理想靶細(xì)胞［23］。另外，有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮抗凋亡、抗炎，促進(jìn)腦損傷組織內(nèi)源性修復(fù)等作用［24-25］。

THAMBISETTY等［26］研究提示apoJ具有保護(hù)神經(jīng)元的作用，本研究通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-apoJ轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，嘗試建立apoJ基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體系，為后續(xù)進(jìn)一步研究apoJ的作用機(jī)制及進(jìn)一步為臨床基因工程干細(xì)胞移植治療腦出血提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-apoJ對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot檢測(cè)，apoJ在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中得以轉(zhuǎn)錄和翻譯，說(shuō)明攜帶外源性apoJ基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建成功?；谏鲜鲈?，采用表達(dá)外源性apoJ的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血，可以產(chǎn)生雙重作用：一方面，外源性攜帶apoJ基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以補(bǔ)充腦出血后腦損傷丟失的細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)上修復(fù)和重建神經(jīng)環(huán)路；另一方面，攜apoJ基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌高水平的apoJ可以改善腦出血部位及周圍組織的微環(huán)境，并通過(guò)多種途徑抑制炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能恢復(fù)。本研究提示攜外源性apoJ基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)構(gòu)建成功，并且外源性目的基因apoJ得到高水平表達(dá)，為進(jìn)一步開展攜apoJ基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦出血的實(shí)驗(yàn)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，希望能夠成為新的腦出血疾病治療措施。

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（張蕾 編輯）

Construction of recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ and its expression in rat bone marrow
mesenchymal stem cells in vitro*

Chong ZHOU1，Xue-liang LIU1，Xiao-mei ZHENG2，Liang LIU1
（1.Department of Neurosurgery，2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital，Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，P.R.China）

【Objective】To construct recombinant plasmid pEGFP-N1-apolipoprotein J（apoJ），transfect it into rat bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs），and detect its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.【Methods】Rat bone marrow MSCs were transiently transfected with the recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ and the transfection efficiency of green fluorescent protein（GFP）was determined. Real-time PCR，Western blot and immunocytochemistry analysis were also performed for detection of apoJ expression in rat bone marrow MSCs.【Results】Transient transfection efficiency reached 35%.After transfection，the transcription of apoJ was detected in MSCs and the expression of apoJ protein was also verified. 【Conclusions】Recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ has been successfully constructed，transfected into rat bone marrow MSCs and expressed in rat bone marrow MSCs.This procedure may be helpful for the application of apoJ to gene therapy and provide the experimental basis for the further study of apoJ as a new treatment of cerebral hemorrhage.

apolipoprotein J（apoJ）；recombinant plasmid；gene transfection；bone marrow mesenchymal stem cell

R-332

A

1005-8982（2015）33-0015-05

2015-06-26

四川省衛(wèi)生廳課題基金（No：110597）

劉亮，E-mail：liulst@163.com；Tel：15348216516