白蒙 胡文學(xué) 付新錄 姜健 莫莉

[摘要] 目的 觀察兔淚道置管術(shù)拔管后的鼻淚管組織的臨床病理變化，探討拔管后阻塞復(fù)發(fā)的機制。 方法 25只新西蘭大白兔，一側(cè)為實驗組，制作成鼻淚管阻塞的模型，另一側(cè)作為對照組。實驗組行鼻淚管置管，28 d后拔管，觀察鼻淚管阻塞的模型及拔管后的臨床表現(xiàn)，拔管當(dāng)天（0 d），拔管后3、7、14、28 d時鼻淚管組織的病理變化。觀察實驗組與對照組的管壁相對厚度、黏膜下組織的成纖維細胞密度、成纖維細胞PCNA陽性率，計算實驗組與對照組之間上述指標(biāo)差值的統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 建模成功的實驗組，均有溢淚，淚道沖洗不通，但分泌物較少，拔管后淚道沖洗通暢，均無溢淚。實驗組鼻淚管組織中海綿狀血管組織相對較少，膠原纖維相對較多，以7 d最為明顯。對照組管壁厚度、成纖維細胞密度、成纖維細胞PCNA陽性率在不同時點均無明顯差異（均P > 0.05）。管壁厚度：拔管7 d時，實驗組明顯大于對照組（P < 0.05）。實驗組7 d時與0 d時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。成纖維細胞密度：拔管7 d時，實驗組明顯高于對照組（P < 0.05）。實驗組7 d時與0 、14 、28 d時比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。成纖維細胞PCNA陽性率：拔管3 、7 d時，實驗組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。實驗組3 d時與0 、14、28 d時比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；7 d時與14 d時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 拔管早期存在成纖維細胞大量增殖現(xiàn)象，有必要適當(dāng)應(yīng)用抗增殖藥以減少復(fù)發(fā)的可能。

[關(guān)鍵詞] 淚道置管術(shù)；鼻淚管；增殖；病理學(xué)；兔

[中圖分類號] R332 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（a）-0033-05

Clinical and pathological change in lacrimal intubation of rabbit after extubation

BAI Meng1 HU Wenxue2 FU Xinlu3 JIANG Jian1 MO Li1

1.Department of Pathology， TCM Hospital of Futian District Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518040， China； 2.Department of Ophthalmology， People's Hospital of Longgang District Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518172， China； 3.Experimental Animal Center of Sun Yat-sen University， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China

[Abstract] Objective To observe the clinical and pathological change in lacrimal intubation of rabbit after extubation， to probe the mechanism of recurrence obstruction after extubation. Methods 25 New Zealand white rabbits， one side of every rabbit was named as experimental group， was made for nasolacrimal duct obstruction model， the other side as control group. Nasolacrimal intubation performed in the experimental eye， with stent for 28 days before extubation. Clinical manifestation of the nasolacrimal duct obstruction model and pathological change of nasolacrimal duct tissue after extubation of 0 day （extubation day）， 3rd day， 7th day， 14th day， 28th day were observed. Relative thickness of the duct， fibroblast density submucosal tissue and PCNA positive rate of fibroblasts in experimental group and control group were observed， statistical differences of indexes which mentioned above were calculated between experimental group and control group. Results The successful of nasolacrimal duct obstruction model eyes were all tearing， syring showed obstruction， but less discharge， after extubation， they were all no tearing. Cavernous blood vessels in experimental nasolacrimal duct were relatively less， the collagen fibers in 7th day were more obvious. There was no significant difference about wall thickness， cell density and PCNA positive rate in control group. Wall thickness： there was significant difference between the two groups at 7 d （P < 0.05）， there was significant difference between 7 d and 0 d in experimental group （P < 0.05）. Cell density： there was significant difference between the two groups at 7 d （P < 0.05）， there was significant difference between 7 d and 0 d，14 d， 28 d in experimental group （P < 0.05）. PCNA positive rate： there was significant difference between the two groups at 3 d and 7 d （P < 0.05 or P < 0.01）， there was significant difference between 3 d and 0 d，14 d， 28 d in experimental group （P < 0.01）， there was significant difference between 7 d and 14 d in experimental group （P < 0.05）. Conclusion In the early stage after extubation， fibroblast proliferation is obviously， so it is necessary to apply appropriately antiproliferative drugs to reduce the recurrence after extubation.

[Key words] Lacrimal intubation； Nasolacrimal duct； Proliferation； Pathology； Rabbit

鼻淚管阻塞及淚囊炎多采用手術(shù)治療。淚道置管術(shù)操作較簡單，面部不留瘢痕，但拔管后存在一定的復(fù)發(fā)率[1-3]。拔管后復(fù)發(fā)的機制，拔管后抗瘢痕治療的時機和療程，臨床存在爭議[1-10]。本研究擬通過電灼損傷結(jié)合縫合法，制造兔鼻淚管阻塞的模型，對兔鼻淚管阻塞模型行淚道置管術(shù)2周，觀察拔管后鼻淚管組織的病理變化，探討拔管后復(fù)發(fā)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗儀器、器材準(zhǔn)備及試劑：WZC-Ⅲ淚道治療儀一套，選用1 mm探針，頭部刮出2 mm無絕緣層區(qū)，兔頭固定器，實驗用手術(shù)器械。普利靈6-0可吸收性縫線，5-0絲線，BD IntimateⅡ22GA1.0型靜脈留置針，穿刺端剪平備用。20%烏拉坦溶液[上海恒遠生物科技有限公司，申藥字（2010）070031582]；0.5%丙美卡因滴眼液（進口藥品注冊證號：H2009008.2）。光學(xué)顯微鏡（日本Olympus，BX-51）；Motic數(shù)字切片掃描系統(tǒng)；德國Leica-RM 2245切片機。

實驗動物：取無溢淚、無面部異常的2月齡健康純種新西蘭大白兔25只（由中山大學(xué)動物實驗室提供），體重2.0～2.5 kg，雌雄兼用。

1.2 方法

淚道阻塞模型的制作：使用帶少許熒光素鈉的生理鹽水注射液沖洗雙眼淚道證實通暢后，新西蘭大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。結(jié)合兔淚道高頻電灼方法[10]對新西蘭大白兔用20%烏拉坦溶液，按5 mL/kg耳緣靜脈麻醉，并用0.5%丙美卡因結(jié)膜表面麻醉3次后，眼部消毒，沿裂隙狀淚點適當(dāng)剪開淚囊至可直視鼻淚管淚囊開口，將探針探入1側(cè)眼鼻淚管淚囊開口處2～3 mm，方向指向同側(cè)上切牙牙冠頂端，20 W功率通電后適當(dāng)旋轉(zhuǎn)并搖擺，通電10 s，完成后予6-0可吸收縫線縫合鼻淚管淚囊開口處1針，制作鼻淚管阻塞模型。術(shù)后兔飼養(yǎng)1周左右，出現(xiàn)溢淚及溢膿癥狀，此時使用不帶針頭的針管直接對鼻淚管口沖洗，沖洗液帶少許熒光素鈉，手術(shù)側(cè)沖洗不通，對側(cè)眼通暢即考慮鼻淚管阻塞模型建立成功。鼻淚管阻塞模型建立成功后繼續(xù)觀察1周，準(zhǔn)備置管術(shù)前每只兔予氯霉素眼藥水雙眼點眼，4次/d，共3 d，控制淚囊炎癥。

置管及固定方法：同樣用烏拉坦全身麻醉及丙美卡因結(jié)膜表面麻醉，用淚道探針自鼻淚管淚囊開口處沿鼻淚管走行方向探入6 mm后，將剪平穿刺端的5號靜脈留置針植入已探通的鼻淚管內(nèi)8 mm，拔出針芯，淚囊內(nèi)暴露2 mm左右的留置針套管，剪掉多余部分，5-0絲線縫合固定于淚囊壁，縫合盡量達骨質(zhì)表面骨膜并加寬針距，防止脫落。淚道沖洗證實通暢后，置管完成。

拔管方法：置管2周后，丙美卡因結(jié)膜表面麻醉后，固定器內(nèi)固定兔頭，剪線并拔管，支架管拔出后立即行淚道沖洗，判斷鼻淚管是否通暢。拔管后予氯霉素眼藥水雙眼點眼，4次/d，共1周（1周內(nèi)處死的動物處死前用藥）。

對照與分組：采用自身對照方法，左右眼隨機分為實驗組及對照組，實驗組制作淚道阻塞模型，植入靜脈留置針作為支架管，對照組適當(dāng)剪開淚囊后不做任何處理。分別于拔管后0（即拔管當(dāng)天）、3、7、14、28 d處死5只。

觀察項目：觀察建模成功后，淚道置管后及拔管后兔的臨床表現(xiàn)。采用麻醉后放血法處死兔，自瞼裂到口裂剪開皮膚皮下，暴露上頜骨、前頜骨及部分顴骨，自上頜骨口側(cè)咬開骨質(zhì)，取出兩側(cè)鼻淚管近淚囊側(cè)的部分。與鼻淚管走行垂直方向切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，采用光鏡觀察淚囊結(jié)合部位管壁組織病理特點，使用數(shù)字切片觀察鼻淚管管壁的相對厚度（以下簡稱“管壁厚度”），每平方毫米成纖維細胞數(shù)量（以下簡稱“細胞密度”），增殖細胞核抗原（PCNA）染色后觀察成纖維細胞PCNA陽性率。

量化方法：切片掃描系統(tǒng)將切片掃描后，結(jié)合瘢痕增生指數(shù)的計算方法[11]，采用低倍視野下（2×）用直尺測量鼻淚管的最大直徑及與之垂直方向上的最大直徑，兩者的平均值為A，相應(yīng)方向上管腔直徑的平均值為B，以1-A/B作為鼻淚管管壁厚度。高倍視野下（20×）觀察隨機5個0.1 mm×0.2 mm網(wǎng)格內(nèi)的成纖維細胞數(shù)乘以10，代表每平方毫米成纖維細胞密度，只計數(shù)成纖維細胞，剔除血管內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、脂肪細胞、上皮細胞等。成纖維細胞PCNA陽性率同樣只計數(shù)成纖維細胞，計數(shù)陽性率最高5個0.1 mm×0.2 mm網(wǎng)格內(nèi)的成纖維細胞數(shù)量和其中的陽性細胞數(shù)量，計算其陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

建模成功的鼻淚管阻塞眼，均有溢淚，淚道沖洗不通，但分泌物較少，經(jīng)抗生素眼液治療炎癥容易控制。淚道置管后溢淚癥狀逐漸減輕，1周后均無溢淚，拔管后淚道沖洗通暢。支架管拔出后觀察0、3、7、14、28 d實驗兔均無溢淚。

2.2 病理變化

對照組鼻淚管組織黏膜下層往往有較多海綿狀血管組織（圖1），而實驗組海綿狀血管組織相對較少，膠原纖維相對較多，以7 d時最為明顯（圖2）。實驗組及對照組淋巴濾泡樣組織均較少見。黏膜層均較完整，未見明顯上皮脫落。

圖1 對照組的病理學(xué)改變（HE染色，20×）

圖2 實驗組7 d時的病理學(xué)改變（HE染色，20×）

2.3 兩組拔管后不同時間管壁厚度的變化

拔管7 d時，實驗組管壁厚度明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。對照組管壁厚度不同時間點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。實驗組7 d時管壁厚度與0 d時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

表1 兩組拔管后不同時間管壁厚度的變化（±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；與實驗組0 d時比較，△P < 0.05

2.4 兩組拔管后不同時間成纖維細胞密度的變化

拔管7 d時，實驗組成纖維細胞密度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。對照組成纖維細胞密度不同時間點比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。實驗組7 d時的成纖維細胞密度與0、14、28 d時比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 兩組拔管后不同時間成纖維細胞密度的變化（細胞數(shù)/mm2，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；與實驗組7 d時比較，△P < 0.05

2.5 兩組拔管后不同時間成纖維細胞PCNA陽性率的變化

拔管3 、7 d時，實驗組與對照組成纖維細胞PCNA陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。對照組成纖維細胞PCNA陽性率在不同時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。實驗組3 d時的成纖維細胞PCNA陽性率與0 、14、28 d時比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；7 d與14 d成纖維細胞PCNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

表3 兩組拔管后不同時間成纖維細胞PCNA陽性率的變化（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；與實驗組3 d時比較，△P < 0.01；與實驗組7 d時比較，▲P < 0.05

3 討論

3.1 兔是鼻淚管阻塞研究較好的實驗動物

兔可作為鼻淚管阻塞研究的實驗動物[12-13]，其鼻淚管骨內(nèi)段雖然走行較直，但骨壁較薄，極易形成假道。本實驗探通時選擇直視鼻淚管淚囊開口，且僅探入8 mm，同時注意手法輕柔，保證不形成假道。

兔淚點為淚滴狀，而非圓形，淚道沖洗時較易反流。在鼻淚管電灼、縫合和探通時，必須將淚囊自淚點開始剪開，否則極易形成假道或操作無法完成。淚囊剪開后，無法采用常規(guī)7號針頭行淚道沖洗，本實驗采用針管直接對鼻淚管口沖洗，沖洗液中加少量的熒光素鈉能直觀地反映鼻淚管是否通暢，同時避免假道形成。

3.2 鼻淚管阻塞的動物模型特點

盡管Rehorek等[12]、胡文學(xué)等[13]認(rèn)為兔鼻淚管骨內(nèi)段的解剖組織結(jié)構(gòu)與人體相似，可作為人鼻淚管研究的動物模型，但鼻淚管阻塞的動物模型較難建立。預(yù)實驗時采用搔刮后注入硬化劑的方法成功率較低（1/4），改用低能量電灼加可吸收縫線縫扎法成功率達100%，但自然狀態(tài)下存在淚囊炎的兔，80%存在牙咬合不良[14]。因兔的鼻淚管下段（鼻內(nèi)段）與上中切牙相鄰且較為狹窄，推測咬合不良可導(dǎo)致鼻淚管下段損傷，進而阻塞及感染，發(fā)生淚囊炎[14]。本研究模擬的人阻塞模型的阻塞部位位于鼻淚管淚囊開口處，與兔自然狀態(tài)下存在的淚囊炎（鼻淚管阻塞）其阻塞部位位于鼻淚管下段不同。同時因為阻塞部位較高，阻塞部位以上的淚道死腔僅局限于淚囊。兔第三眼瞼發(fā)達，淚囊位于第三眼瞼下，瞬目反射擠壓淚囊概率較大，同時兔淚囊被部分切開，淚囊內(nèi)潴留的淚液容易反流排出，因而淚囊炎癥反應(yīng)較輕，分泌物少。適當(dāng)抗生素眼藥局部應(yīng)用，炎癥易于控制。

3.3 拔管后存在增殖期

置管治療兔鼻淚管阻塞的療效較好，治愈率為100%，拔管后阻塞均沒有復(fù)發(fā)，考慮與制作的阻塞模型阻塞部位的長度較短、置管相對較粗有關(guān)。拔管當(dāng)天，實驗組與對照組管壁厚度與成纖維細胞密度相似，考慮實驗選用的置管材料直徑較為合適，同時與組織相容性好，對組織的影響較小。拔管7 d后，成纖維細胞數(shù)量達到最多，之后逐漸下降，考慮解除置管壓迫后，阻塞部位的成纖維細胞增殖在一段時間內(nèi)會較活躍。PCNA在G0～G1期細胞中無明顯表達，在G1晚期，其表達大幅度增加，S期達到高峰，其量的變化與DNA合成一致，可作為評價細胞增殖狀態(tài)的一個敏感指標(biāo)[15-17]。成纖維細胞PCNA陽性率拔管后3 d明顯升高，14 d后逐漸下降，同樣提示拔管后存在成纖維細胞的增殖。如阻塞的部位較長，置管相對較小，拔管損傷了黏膜上皮，拔管后成纖維細胞的增殖未得到有效控制，拔管后復(fù)發(fā)的概率將大大增加。兔鼻淚管骨內(nèi)段與人鼻淚管組織結(jié)構(gòu)相似，臨床淚道置管患者，拔管后可能同樣存在成纖維細胞增殖過程，結(jié)合兔鼻淚管纖維細胞增殖的規(guī)律，拔管后應(yīng)用2周左右的抗增殖藥是合適的。

總之，淚道置管術(shù)后拔管早期，存在明顯的成纖維細胞增殖過程，此時適當(dāng)應(yīng)用抗增殖藥，有望減少拔管后復(fù)發(fā)的可能性。

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（收稿日期：2015-03-02 本文編輯：李亞聰）