龍德彪，周 錦，徐鑫，鄭池樂，周東升

(衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南衡陽 421008)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來越來越多的人受到不斷增加的工作和生活壓力，不同職業(yè)的人都可能處于不同程度的睡眠剝奪(Sleep deprivation，SD)狀態(tài)。研究表明，睡眠剝奪影響機(jī)體的代謝、免疫系統(tǒng)、應(yīng)激及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面，與人體的各種疾病如心血管疾病，肥胖癥，精神焦慮，抑郁癥等的發(fā)生密切相關(guān)［1－3］。被動(dòng)的睡眠剝奪已經(jīng)成為日益突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問題。

目前，有關(guān)睡眠剝奪導(dǎo)致的雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的研究較為少見。研究表明，72 h的睡眠剝奪會(huì)造成雄性小鼠性行為異常和生殖系統(tǒng)的不良影響［4－5］，還有研究表明對(duì)小鼠進(jìn)行一定時(shí)間的睡眠剝奪后可引起雄性小鼠的生殖毒性效應(yīng)［6］。但是，中等時(shí)長(zhǎng)(如36 h)的睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠性行為及精子活力的影響仍缺乏深入明確的認(rèn)識(shí)。筆者采用輕微改良的輕柔刺激法研究36 h睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的影響，以睡眠剝奪后捕捉次數(shù)、捕捉潛伏期、精子活率和精子畸變率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在為睡眠剝奪影響雄性動(dòng)物生殖行為及精子質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取雄性昆明小鼠24只，體重(26±4)g，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，12 h光照、12 h黑暗處理，室溫為(25±5)℃，所有小鼠均正常取食與給水。將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成2組，每組12只，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)分組 采用改良的輕柔刺激法［7］，實(shí)驗(yàn)人員輪流值班，拍打小鼠籠發(fā)出聲音，從而使小鼠不能進(jìn)入睡眠狀態(tài)。如果小鼠長(zhǎng)時(shí)間不睡眠而陷入不活躍狀態(tài)，則用棍狀物直接刺激小鼠使其無法進(jìn)入睡眠。對(duì)照組，不作睡眠剝奪(SD)處理;試驗(yàn)組，第1天8:00到次日20:00SD處理36 h;正常飼喂與飲水。

1.3 方法

1.3.1 小鼠性行為。36 h SD處理后，保持實(shí)驗(yàn)室安靜，將處理組和對(duì)照組的成熟雄性小鼠放入290 mm×178 mm ×160 mm的鼠籠中適應(yīng)5 min，接著與2只同批飼養(yǎng)的成熟雌性小鼠形成1∶2配對(duì)，觀察30 min。觀察指標(biāo)包括:①捕捉潛伏期(Capture incubation period，CIP):計(jì)算雌鼠投入到鼠籠直到雄鼠第1次捕捉雌鼠的時(shí)間。②捕捉次數(shù)(Capture times，CT):自雌鼠投入到鼠籠開始，雄鼠撲捉雌鼠的動(dòng)作，主要是爬背或添陰動(dòng)作次數(shù)。

1.3.2 精子活率。解剖小鼠后，將任意一側(cè)附睪用剪刀剪碎，然后放入1 ml的0.86%生理鹽水中，生理鹽水需要預(yù)熱至37℃，再水浴10 min，制成精子懸液。取1滴懸液，滴于載玻片，在顯微鏡(100×)暗視野下觀察，共觀察200個(gè)精子，使用計(jì)數(shù)器手動(dòng)記錄下精子運(yùn)動(dòng)情況。將精子活力依據(jù)文獻(xiàn)分級(jí):A.快速直線向前;B.慢速直線向前或轉(zhuǎn)動(dòng)向前;C.原地顫動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng);D.不活動(dòng)。精子活率=A+B+C/A+B+C+D［8］。

1.3.3 精子畸變率。取“1.3.2”的精子懸浮液進(jìn)行涂片，玻片干燥后用甲醇固定5 min。干后用2%伊紅(Eosin)水溶液染色1 h［9］。檢查精子形態(tài)，每只小鼠檢查完整的精子1 000條。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，首先對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布和方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果以SE表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 性行為觀察 從圖1可以看出，小鼠捕捉潛伏期在36 h SD處理后較對(duì)照組延長(zhǎng)，與對(duì)照組存在極顯著差異(P＜0.01)，處理組捕捉潛伏期極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

圖1 SD處理對(duì)小鼠捕捉潛伏期的影響

從圖2可以看出，36 h SD處理后，處理組捕捉次數(shù)極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

圖2 SD處理對(duì)小鼠捕捉次數(shù)的影響

2.2 精子活率 從圖3可以看出，SD處理36 h后小鼠的精子活率比對(duì)照組(0 h)低，且存在顯著性差異(P＜0.05);對(duì)照組A級(jí)精子數(shù)明顯高于處理組，且36 h處理組有4只小鼠沒有觀察到A級(jí)精子。

圖3 SD處理對(duì)小鼠精子活率的影響

2.3 精子畸變率 從圖4可以看出，小鼠精子畸變率在SD 36 h處理后較對(duì)照組有明顯升高，且處理組與對(duì)照組存在極顯著差異(P＜0.01)。36 h SD組多見明顯畸變精子，以尾折疊、不定形頭部為常見。

圖4 SD處理對(duì)小鼠精子畸變率的影響

3 結(jié)論與討論

雄性動(dòng)物的捕捉潛伏期(Capture incubation period，CIP)和捕捉次數(shù)(Capture times，CT)的改變作為一種生殖行為異常的特征，已被許多學(xué)者推薦或用于評(píng)價(jià)雄性生殖行為異常［4，10］。CIP和CT的改變是評(píng)價(jià)性功能的最優(yōu)指標(biāo)。該研究表明，睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠CIP和CT有顯著影響，與對(duì)照組相比睡眠剝奪36 h可使雄性小鼠潛伏期極顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，捕捉次數(shù)極顯著減少(P＜0.01)。這表明中長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪(36 h SD)可使小鼠性行為能力明顯降低。

研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪可使小鼠精子活率顯著下降［5］。該研究表明中長(zhǎng)時(shí)間(36 h)睡眠剝奪也可使精子活率有明顯的下降趨勢(shì)(P＜0.05)。睡眠剝奪能使精子活率下降，可能與氧自由基生成過多產(chǎn)生氧化應(yīng)激有關(guān)［11］。該研究還發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪36 h可使小鼠精子畸變率極顯著升高(P＜0.01)，其精子畸變多表現(xiàn)為無鉤、胖頭、無定形、尾折疊。尤其尾折疊和無定形現(xiàn)象已經(jīng)比較明顯，說明36 h的睡眠剝奪已經(jīng)對(duì)雄性動(dòng)物精子質(zhì)量及子代健康造成嚴(yán)重威脅。

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