于代華，孫緒德，柴 偉，高昌俊

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，西安 710038）

針對急性腦損傷神經(jīng)保護(hù)的研究雖然很多，但是目前尚沒有一種理想的藥物應(yīng)用于臨床，因此，尋找新型高效的腦保護(hù)藥物以防治急性腦損傷是臨床上亟待解決的難題。近年研究發(fā)現(xiàn)，重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rh－EPO）不僅對腎臟具有保護(hù)作用［1－3］，對心臟［4－7］和中樞神經(jīng)系統(tǒng)同樣具有良好的保護(hù)作用，是對預(yù)防和治療急性腦損傷具有很好的臨床應(yīng)用前景［8－9］。研究表明rh－EPO可降低缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞外谷氨酸濃度升高、降低谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡、減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的缺血再灌注損傷，在基礎(chǔ)與臨床研究中均表現(xiàn)出對腦缺血再灌注的保護(hù)作用［10］。但rh－EPO并非通過增加紅細(xì)胞容積來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［11］，目前其作用機(jī)制，尤其是細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制還不明確，為臨床的進(jìn)一步應(yīng)用帶來困難，成為一個(gè)亟待解決的涉及基礎(chǔ)理論的臨床問題。

本實(shí)驗(yàn)擬在大鼠急性腦損傷模型的基礎(chǔ)上，以谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT－1和GLAST信號通路為切入點(diǎn)，研究rh－EPO對急性腦損傷的保護(hù)作用及對GLT－1和GLAST表達(dá)的影響，以闡明GLT－1和GLAST信號通路在rh－EPO誘導(dǎo)急性腦損傷保護(hù)機(jī)制中的作用，為探討急性腦損傷保護(hù)提供新的手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 rh－EPO注射液（國藥準(zhǔn)字號S20010001，10000國際單位／支）由沈陽三生制藥股份有限公司生產(chǎn)。大鼠GLT－1、GLAST ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。Bio－Rad蛋白定量試劑盒、熒光染料SYBR GreenⅡ購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 60只SD大鼠（300～350g，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供）分為3組：對照組（n＝18）、急性腦損傷組（n＝22）和rh－EPO處理組（n＝20），急性腦損傷組和EPO處理組用自由落體打擊器制作腦外傷模型，rh－EPO處理組在制作腦損傷模型15min后經(jīng)腹腔注射rh－EPO 3000 U／kg。各組大鼠實(shí)驗(yàn)完成48h后，3%戊巴比妥（10mg／kg）過量麻醉，立即斷頭取腦。

1.3 急性腦損傷模型的制備［12］采用改良Feeney′s自由落體打擊器制作急性腦損傷模型。將大鼠提前3d單獨(dú)喂養(yǎng)，術(shù)前禁食8h。實(shí)驗(yàn)時(shí)用10%水合氯醛以350mg／kg體質(zhì)量腹腔注射進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定向儀（江灣1型）上。消毒皮膚，正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm，中線旁2.5mm處鉆一直徑5.0mm骨窗，保持硬膜完整。將撞桿置于硬膜上，用20g砝碼于30cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，致右頂葉輕度腦挫裂傷，致傷沖擊力大小為600g／cm。打擊后切口內(nèi)滴注4×104U硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。對照組僅開顱窗后用骨蠟封閉，不施加打擊。

1.4 RT－PCR 檢測 GLT－1和 GLAST mRNA表達(dá)量變化提取各組組織勻漿總RNA，行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。引物設(shè)計(jì)采用Primer Express（ABI公司，美國），在Prism 7500real time－PCR儀（ABI公司，美國）上進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。設(shè)計(jì)GLT－1引物序列：上 游 5′－CAG AGG GAC AAC AGC AAT GA－3′，下游5′－CCG TGT AAA CCA AAG CCT A－3′，擴(kuò)增片段長度為299bp。退火溫度為51℃，32次循環(huán)。用β－actin作為內(nèi)參照，采用熒光染料SYBR GreenⅡ進(jìn)行標(biāo)記，用ABI Prism 7500SDS軟件分析PCR反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù)。

1.5 Western blot檢測GLT－1和GLAST蛋白量的變化 將收集的組織勻漿用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解，然后用Bio－Rad蛋白定量試劑盒（Bio－Rad公司，美國）進(jìn)行蛋白定量。取20μg處理好的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，將PVDF膜與第一抗體（1∶1000）4℃孵育過夜；PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入第二抗體室溫孵育1h，再次洗膜3次，每次10min。使用化學(xué)發(fā)光法顯影檢測目的蛋白的條帶變化，并以β－actin作為對照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析（ANOVA）處理，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

大鼠腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST mRNA表達(dá)量以相對端粒酶活性表示，與對照組比較，急性腦損傷后48h，急性腦損傷組腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST mRNA表達(dá)較對照組均顯著降低（P＜0.01）；與急性腦損傷組比較，rh－EPO處理組 GLT－1和GLAST mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

與對照組比較，急性腦損傷后48h，急性腦損傷組腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與急性腦損傷組比較，rh－EPO處理組GLT－1和GLAST蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖1 RT－PCR檢測各組GLT－1和GLAST mRNA表達(dá)變化（n＝10）

圖2 Western blot檢測各組GLT－1和GLAST蛋白表達(dá)變化（n＝10）

3 討 論

一般認(rèn)為，EPO作為一種促紅細(xì)胞生長因子，可促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化。近年來許多研究均表明EPO除了增加紅細(xì)胞容積之外，對重要器官如腎臟、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的缺血缺氧性損傷具有明確的保護(hù)作用。此前對于EPO是否能透過血腦屏障的問題也曾有過爭議，有學(xué)者提出，EPO是一種分子量巨大的糖蛋白，靜脈注射不能透過血腦屏障到達(dá)腦部，但Brines等［13］研究表明，EPO是一種能被選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)的大分子物質(zhì)，在缺乏神經(jīng)損傷時(shí)，EPO可以由血液循環(huán)透過血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。將rh－EPO進(jìn)行生物素標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，靜脈注射5 h后可在動物血腦屏障微血管周圍觀察到生物素標(biāo)記的rh－EPO并且進(jìn)入了腦實(shí)質(zhì)，說明rh－EPO是可以透過血腦屏障的。另外，血腦屏障受損也可使rh－EPO加速通過血腦屏障。

大量動物和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺血缺氧時(shí)腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，細(xì)胞外高谷氨酸濃度與神經(jīng)損傷密切有關(guān)，這也可能是導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷的主要原因［14］。谷氨酸既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)也具有興奮性神經(jīng)毒性，細(xì)胞外過高的谷氨酸產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。在正常情況下，谷氨酸儲存于突觸前的囊泡內(nèi)，當(dāng)動作電位到達(dá)神經(jīng)接頭時(shí)，谷氨酸被釋放到突觸間隙，將神經(jīng)沖動的信號傳遞到突觸后神經(jīng)元。通常，釋放到突觸間隙的谷氨酸主要由星型膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT－1和GLAST回收到細(xì)胞內(nèi)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺，然后安全地轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元。過表達(dá)GLT－1可明顯降低缺氧導(dǎo)致的腦損傷［15］。在多種表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中，GLT－1和GLAST主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞，類似于離子通道樣作用的GLT－1和GLAST回吸收了90%的遞質(zhì)性谷氨酸，在調(diào)節(jié)突出間隙興奮性谷氨酸濃度中起重要作用。用GFAP啟動子控制的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異過表達(dá)GLT－1，在氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)性腦片中對神經(jīng)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用［16－17］。在病理?xiàng)l件下，如果 GLT－1和 GLAST的轉(zhuǎn)運(yùn)活性下降或表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致胞外谷氨酸濃度升高并引起興奮性神經(jīng)毒性。此時(shí)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體也可能發(fā)生雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，將細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，增加谷氨酸的神經(jīng)毒性［18］。除膠質(zhì)細(xì)胞外，神經(jīng)元也少量表達(dá)GLT－1和GLAST，轉(zhuǎn)運(yùn)少量谷氨酸進(jìn)入細(xì)胞。

EPO對急性腦損傷的保護(hù)作用是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但目前機(jī)制仍不十分清晰［19－22］。本研究結(jié)果表明，急性腦損傷后48h，大鼠腦損傷區(qū)GLT－1和GLAST表達(dá)顯著降低，而rh－EPO處理后GLT－1和GLAST較急性腦損傷組顯著增加，說明GLT－1／GLAST信號機(jī)制在rh－EPO對急性腦損傷的保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，rh－EPO可以有效減輕急性腦損傷，減少損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，具有明確的腦保護(hù)作用。但rh－EPO的這種急性腦保護(hù)作用并非來源于rh－EPO本身的促紅細(xì)胞生成活性，可能與上調(diào)GLT－1和GLAST的轉(zhuǎn)運(yùn)活性和表達(dá)水平有關(guān)。

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