覃維含 吳原 陳鎮(zhèn) 劉夕霞 黃逸青

既往研究表明，癲癇發(fā)作可導(dǎo)致血－腦脊液屏障功能紊亂及結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)白蛋白通透性增加［1］。腦組織中較高水平白蛋白可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)S100B和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)水平改變，且腦細(xì)胞損傷時(shí)，腦脊液及血清中S100B水平亦會(huì)增高［2］。S100B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）炎性反應(yīng)中起啟動(dòng)和維持作用。GFAP表達(dá)量與血－腦脊液屏障的形成密切相關(guān)，GFAP缺乏可導(dǎo)致血－腦脊液屏障形成缺陷［3］。本研究采用ELISA及免疫組化染色方法檢測(cè)海人酸（kainic acid，KA）顳葉癲癇模型大鼠腦脊液白蛋白、S100B及腦組織內(nèi)白蛋白、S100B及GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)的變化規(guī)律，為探討顳葉癲癇中血－腦脊液屏障的破壞及白蛋白、S100B和GFAP與顳葉癲癇的關(guān)系積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康雄性SD大鼠〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用許可證為：SCXK（桂）2009－0002〕75只，體質(zhì)量（250±15）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑：白蛋白 ELISA 試劑盒（CSBE14410r，武漢華美生物工程有限公司），S100B蛋白ELISA試劑盒（CK－E30417R，蘇州卡爾文生物科技有限公司），白蛋白及S100B蛋白免疫組化一抗（分別為ab106582、ab52642，英國(guó) Abcam 公司），GFAP一抗（BA0056，武漢博士德生物工程有限公司），免疫組化二抗（sp9000，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation，日本）。

1.2 方法 模型組于側(cè)腦室注射KA后6h、24 h、3d和7d，生理鹽水對(duì)照組（對(duì)照組）注射等量生理鹽水后6h，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行觀察取材。動(dòng)物按上述時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為5組，每組各15只。

1.2.1 癲癇動(dòng)物模型制備：參照Paxinos大鼠腦立體定位圖譜定位于大鼠右側(cè)側(cè)腦室，坐標(biāo)為前囟往后0.8mm，中線旁開(kāi)1.3mm，硬膜下3.7mm，以1μL微量注射器將KA溶液（2μg／kg）緩慢注入側(cè)腦室，控制注射速度為0.05μL／min。依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將大鼠行為分為5級(jí)：Ⅰ級(jí)：面肌抽動(dòng)，節(jié)律性咀嚼動(dòng)作；Ⅱ 級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭或“濕狗樣”抖動(dòng)（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ 級(jí)：一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ 級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣伴站立；Ⅴ級(jí)：跌倒、全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作。以Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作的大鼠作為成功癲癇模型。4個(gè)模型組共有57只大鼠造模成功納入下一步實(shí)驗(yàn)，其中模型組6h15只、模型組24h14只、模型組3d14只、模型組7d14只。對(duì)照組僅于側(cè)腦室注入等體積的生理鹽水。

1.2.2 腦脊液標(biāo)本采集及石蠟切片制備：以開(kāi)始側(cè)腦室注藥為起點(diǎn)，模型組大鼠分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)、對(duì)照組在注射生理鹽水后6h采用枕骨大孔直接穿刺法抽取腦脊液（被血液污染的腦脊液棄用），以4500r／min離心10min后取上清液儲(chǔ)存于－20℃冰箱保存?zhèn)錂z。將大鼠依次使用生理鹽水250mL及4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛溶液250 mL進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦，在大腦腹側(cè)面的視交叉及下丘腦后區(qū)乳頭體兩處對(duì)其進(jìn)行冠狀切片，將中間包含海馬部分的腦組織用4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛固定24h后，脫水透明浸蠟后用石蠟包埋、切片，片厚4μm。

1.2.3 腦脊液白蛋白及S100B濃度檢測(cè)：在采集腦脊液后第二天采用雙抗體夾心法（ELISA）測(cè)定腦脊液中白蛋白及S100B濃度，具體操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 腦組織白蛋白、S100B及GFAP水平檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法對(duì)腦組織切片進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)，用3%（體積分?jǐn)?shù)）過(guò)氧化氫覆蓋組織切片20min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉20min，分別加白蛋白（1∶40）、S100B蛋白（1∶450）、GFAP（1∶50）一抗于4℃過(guò)夜，之后置生物素化二抗工作液37℃恒溫箱20min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液20min，DAB顯色3～10min。于200倍光學(xué)顯微鏡下采集圖片，觀察白蛋白（表達(dá)在側(cè)腦室室管膜、海馬CA3區(qū)及第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)）、S100B及GFAP（后兩種物質(zhì)表達(dá)在海馬區(qū)）表達(dá)情況，使用Image－Pro Plus軟件分別測(cè)量累計(jì)光密度值（integrated optical density，IOD）及陽(yáng)性表達(dá)面積（area），計(jì)算平均光密度值（IOD／area比值）。平均光密度值高提示目標(biāo)蛋白表達(dá)量高。DAB染色后三種目標(biāo)蛋白表達(dá)均呈棕黃色。

1.2.5 HE染色了解海馬CA3區(qū)結(jié)構(gòu)改變：對(duì)腦組織切片常規(guī)進(jìn)行HE染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下采集2張海馬CA3區(qū)圖片觀察其神經(jīng)元排列及結(jié)構(gòu)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用one－way ANOVA法；若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊，則采用Welch檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液白蛋白、S100B檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表1。模型組6h白蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)白蛋白水平兩兩比較，模型組7d、模型組3d低于模型組6h（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦脊液S100B水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)S100B水平間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中以模型組3d時(shí)腦脊液S100B濃度最高。

2.2 腦組織白蛋白、S100B及GFAP檢測(cè)

2.2.1 側(cè)腦室室管膜、第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)及海馬CA3區(qū)白蛋白表達(dá)：模型組及對(duì)照組大鼠側(cè)腦室室管膜邊緣均可以看到棕黃色白蛋白附著（圖1）；4個(gè)模型組均有個(gè)別大鼠第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)白蛋白長(zhǎng)條或塊狀表達(dá)（圖2）；模型組各時(shí)間點(diǎn)均有個(gè)別樣本中觀察到在CA3區(qū)有白蛋白表達(dá)，以模型組3d時(shí)最為明顯（圖3）。

白蛋白在海馬CA3區(qū)（模型組6h、24h、7d時(shí)各2只，3d時(shí)3只）及第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)（模型組24h時(shí)1只，6h、3d及7d時(shí)各3只）表達(dá)的大鼠數(shù)非常少，故僅對(duì)側(cè)腦室室管膜白蛋白表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別與對(duì)照組比較，模型組24h及模型組6h時(shí)側(cè)腦室室管膜白蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），3d及7d時(shí)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)白蛋白表達(dá)兩兩比較，3d、7d時(shí)均低于模型組6h（P＜0.05），模型組7d時(shí)亦低于其他2個(gè)模型組（均P＜0.05）（表1）。

2.2.2 海馬區(qū)S100B表達(dá)比較：模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)S100B表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；模型組24h、3d和7d時(shí)S100B表達(dá)均高于模型組6h時(shí)（P＜0.05），且模型組7d時(shí)低于模型組3d時(shí)（P＜0.05）（圖3，表1）。各組大鼠海馬齒狀回均可見(jiàn)棕黃色S100B表達(dá)，其中模型組3dS100B表達(dá)最多，模型組7d次之（圖4）。

2.2.3 海馬區(qū)GFAP蛋白表達(dá)比較：模型組3d、7d時(shí)海馬區(qū)GFAP表達(dá)均高于對(duì)照組（均P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)GFAP表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組 3d、7d時(shí)GFAP表達(dá)均高于模型組24h與6h時(shí)（均P＜0.05），且7d時(shí)GFAP表達(dá)亦高于3d時(shí)（P＜0.05）（圖5，表1）。各組大鼠海馬齒狀回及門(mén)區(qū)均可見(jiàn)棕黃色GFAP表達(dá)，模型組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組增多，模型組4組隨時(shí)間往后推移GFAP表達(dá)逐漸增多、染色加深（圖5）。

2.3 HE染色 對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯異形細(xì)胞及細(xì)胞核深染、碎裂等（圖6A）。模型組6h時(shí)海馬CA3區(qū)即出現(xiàn)神經(jīng)元排列紊亂（圖6B中黑箭頭所示）、部分細(xì)胞核深染（圖6B中白箭頭所示）；模型組24h時(shí)細(xì)胞排列紊亂（圖6C中黑箭頭所示），由圓形改變?yōu)槎嘈涡愿淖儯▓D6C中白箭頭所示）；模型組3d時(shí)多數(shù)細(xì)胞形態(tài)多形性改變，細(xì)胞層次減少（圖6D中箭頭所示）；模型組7d時(shí)細(xì)胞排列分散、細(xì)胞壞死（圖6E中箭頭所示）。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦脊液中白蛋白、S100B及腦組織白蛋白、S100B及GFAP表達(dá)比較 （）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦脊液中白蛋白、S100B及腦組織白蛋白、S100B及GFAP表達(dá)比較 （）

注：表中n值為成功采集到腦脊液的大鼠；與對(duì)照組6h比較，＊P＜0.05；與模型組6h比較，＃P＜0.05；與模型組24h比較，▲P＜0.05；與模型組3d比較，△P＜0.05

）］模型組7d 9 138.52±31.16＃ 41.37±3.14＊?！?0.335±0.002＃▲△ 0.341±0.007＊?！?0.351±0.024＊?！鹘M別 n 腦脊液白蛋白（μg／mL） S100B（pg／mL） 腦組織（IOD／area）白蛋白［lg（1／trans）］ S100B［lg（1／trans）］ GFAP［lg（1／trans模型組3d 7 150.42±39.71＃ 68.50±5.63＊?！?0.345±0.003＃ 0.366±0.015＊＃ 0.306±0.026＊＃▲模型組24h 8 153.19±34.80 49.08±2.79＊＃ 0.350±0.005＊ 0.353±0.025＊＃ 0.243±0.011模型組6h 8 188.75±42.87＊ 36.60±2.77＊ 0.352±0.004＊ 0.304±0.023＊ 0.232±0.009對(duì)照組6h 10 127.45±28.32 31.60±3.55 0.338±0.009 0.268±0.013 0.231±0.012 F值0.007 0.000 0.000 0.000 0.0 4.12 121.58 10.24 44.49 60.82 P值

圖1 各組大鼠側(cè)腦室白蛋白（圖中箭頭所示）表達(dá)（免疫組化×200）圖2 各組大鼠第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)白蛋白（圖中箭頭所示）表達(dá)（免疫組化×200）

圖3 各模型組大鼠海馬CA3區(qū)白蛋白（圖中箭頭所示）表達(dá)（免疫組化×200）

圖4 各組大鼠海馬齒狀回S100B（圖中箭頭所示）表達(dá)（免疫組化×200）圖5 各組大鼠海馬齒狀回及門(mén)區(qū)GFAP（箭頭所示）表達(dá)（免疫組化×200）圖6 各組大鼠海馬CA3區(qū)形態(tài)改變（HE×200）：神經(jīng)元排列紊亂（圖B中黑箭頭所示）、部分細(xì)胞核深染（圖B中白箭頭所示）；模型組24h細(xì)胞排列紊亂（圖C中黑箭頭所示），由圓形改變?yōu)槎嘈涡愿淖儯▓DC中白箭頭所示）；模型組3d時(shí)多數(shù)細(xì)胞形態(tài)多形性改變，細(xì)胞層次減少（圖D中箭頭所示）；模型組7d時(shí)細(xì)胞排列分散、細(xì)胞壞死（圖E中箭頭所示）

3 討論

正常情況下，血－腦脊液屏障對(duì)白蛋白的通透性很小。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致血－腦脊液屏障損傷，使其對(duì)白蛋白的通透性增高，損傷程度與癲癇發(fā)作形式及疾病分期密切相關(guān)，癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）及癲癇急性期血－腦脊液屏障損傷更加嚴(yán)重，白蛋白在海馬等腦區(qū)的表達(dá)更多、分布更廣泛［4］。

腦內(nèi)白蛋白可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）信號(hào)傳導(dǎo)通路激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，并激活腦內(nèi)先天性免疫系統(tǒng)，干擾細(xì)胞外鉀離子及谷氨酸平衡，使神經(jīng)元興奮性增高、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)改變［5］。Ivens等［6］曾報(bào)道將腦組織直接暴露在白蛋白中也可誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。另有研究顯示，在癲癇相關(guān)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤的膠質(zhì)細(xì)胞中可觀察到大量白蛋白被攝取，而病灶周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)白蛋白的攝取非常少［6］，提示血－腦脊液屏障功能障礙和白蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中累積可能是癲癇新的致癇機(jī)制。在本研究中，模型組6h時(shí)癲癇大鼠腦脊液白蛋白高于對(duì)照組，白蛋白在各模型組個(gè)別大鼠第一軀體感覺(jué)皮質(zhì)及海馬CA3區(qū)異常沉積，CA3區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及排列改變、壞死等，也提示癲癇發(fā)作可以造成血－腦脊液屏障損傷，腦內(nèi)白蛋白異常出現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元有一定損傷作用。模型組6h、模型組24h腦脊液及腦組織中白蛋白均高于對(duì)照組，之后白蛋白表達(dá)逐漸減少，3d、7d時(shí)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示首次癲癇發(fā)作對(duì)血－腦脊液屏障的結(jié)構(gòu)和功能造成的損傷可能是一過(guò)性的。

在CNS中S100B主要由血管外周的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，當(dāng)細(xì)胞損傷及血－腦脊液屏障損害時(shí)，腦脊液及血清中S100B水平增高，前者尤為顯著［2］，且血清、腦脊液中S100B水平可先于腦內(nèi)壓、神經(jīng)影像以及神經(jīng)病理改變前發(fā)生變化。Zongo等［7］通過(guò)比較分析頭部輕微創(chuàng)傷患者的CT掃描結(jié)果和血清S100B水平發(fā)現(xiàn)，血清S100B＜0.12ng／mL的患者腦內(nèi)出現(xiàn)明顯影像學(xué)改變或者嚴(yán)重后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)很小。癲癇發(fā)作時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞可加倍合成S100B蛋白，高水平S100B具有高度神經(jīng)膠質(zhì)激活和促進(jìn)神經(jīng)炎性反應(yīng)損傷的作用，刺激自身及小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子及一氧化氮（NO），導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙。蜂肽毒可通過(guò)與S100B分子內(nèi)部參與鈣離子結(jié)合的氨基酸殘基的相互作用干擾S100B在癲癇發(fā)作中的作用，被作為治療癲癇的藥物之一［8］。本研究中，模型組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)癲癇大鼠腦脊液及海馬區(qū)S100B表達(dá)均高于對(duì)照組，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元變性、壞死且數(shù)量減少，提示癲癇發(fā)作可能導(dǎo)致腦損傷，高水平S100B可能通過(guò)促進(jìn)炎性反應(yīng)加重了神經(jīng)元損傷，其可能原因?yàn)榘d癇發(fā)作不僅可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，而且可以破壞星形膠質(zhì)細(xì)胞及血－腦脊液屏障，使腦脊液及腦組織S100B含量增高。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白及特異性標(biāo)志物。有實(shí)驗(yàn)研究表明，GFAP缺如條件下小鼠對(duì)腦缺血損傷具有更高的敏感性，同時(shí)誘導(dǎo)血－腦脊液屏障形成過(guò)程存在缺陷［3］，提示GFAP對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用，且對(duì)血－腦脊液屏障完整性形成具有重要作用。GFAP＋／＋星形膠質(zhì)細(xì)胞可以誘導(dǎo)非神經(jīng)源性內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)K＋（鉀離子）、14C蔗糖及8磺茶堿（8－SPT）選擇性通透［9］。在 GFAP－／－小鼠，脊髓和視神經(jīng)的血－腦脊液屏障結(jié)構(gòu)單薄，血管數(shù)目減少、發(fā)育不良，對(duì)125碘－（125I－）標(biāo)記的白蛋白的通透性明顯增加［10］。本研究中，模型組3d及7 d時(shí)癲癇大鼠海馬區(qū)GFAP水平高于對(duì)照組，提示癲癇發(fā)作后星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)GFAP表達(dá)水平降低腦對(duì)缺血缺氧的敏感性及對(duì)損傷的血－腦脊液屏障進(jìn)行修復(fù)。癲癇發(fā)作后大鼠海馬區(qū)GFAP表達(dá)隨著時(shí)間的推移逐漸增多，提示癲癇發(fā)作后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生程度增強(qiáng)。

綜上可見(jiàn)，癲癇發(fā)作后大鼠腦組織中白蛋白、S100B及GFAP表達(dá)異常增高。白蛋白為腦外源性物質(zhì)，在血－腦脊液屏障損傷時(shí)即可通過(guò)血－腦脊液屏障，故腦脊液及腦組織中白蛋白水平變化快，而S100B及GFAP由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生及分泌，兩者的半衰期不同，因此在腦脊液或腦組織中水平增高時(shí)間點(diǎn)不同。但白蛋白、S100B及GFAP在癲癇發(fā)病機(jī)制中的具體作用亟待進(jìn)一步研究。

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