王　慰，楊　莉，高恒波，鄭歡偉，李兵順

不同血清HBV DNA載量慢性乙型肝炎病毒攜帶者外周血T淋巴亞群的變化*

王慰，楊莉，高恒波，鄭歡偉，李兵順

【摘要】目的探討不同病毒載量乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者外周血T細(xì)胞亞群的變化。方法使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)86例慢性HBV攜帶者和22例正常人外周血T細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞亞群；采用熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA載量。結(jié)果血清HBV DNA低載量HBV攜帶者外周血CD3+和CD4+細(xì)胞百分比分別為（65.6±12.5）%和（32.1±9.5）%，HBV陰性組分別為（63.8±13.3）%和（31.6±11.3%），均顯著低于正常人［分別為（72.1±5.0）%和（39.1±5.3）%，P＜0.05］；HBV DNA低載量組CD8+細(xì)胞百分比為（25.8±7.1）%，與正常人的（27.6±4.3）%比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；HBV DNA高載量組外周血CD3+、CD8+細(xì)胞百分比分別為（73.2±9.5）%、（30.0±8.5）%，CD4+細(xì)胞為（37.6±6.4）%，與正常人比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論隨著血清HBV DNA載量的升高，HBV攜帶者T淋巴細(xì)胞亞群處于接近正常水平，其發(fā)生機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究

【關(guān)鍵詞】慢性乙型肝炎病毒攜帶者；T淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)；病毒載量

乙型肝炎病毒（HBV）感染機(jī)體所引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)對(duì)病毒的清除是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。T淋巴細(xì)胞亞群在此免疫反應(yīng)過(guò)程中起主要作用［1，2］。我國(guó)HBV攜帶者超過(guò)

1.2億，其中一些人會(huì)發(fā)展至乙型肝炎、肝硬化和肝癌［3，4］。本文檢測(cè)了不同病毒載量的HBV攜帶者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1病例來(lái)源2012年10月～2013年3月期間我科診治的慢性HBV攜帶者86例，男64例，女22例；年齡15～62歲，平均年齡為（37.5±12.6）歲。臨床診斷符合慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）的標(biāo)準(zhǔn)［5］。所有患者半年內(nèi)未用過(guò)抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑。另選正常人22例，男性15例，女性7例；年齡18～60歲，平均年齡（39.7±12.9）歲，排除乙型肝炎、高血壓病、冠心病、糖尿病。兩組人群性別和年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)抽取靜脈血2 ml，EDTA抗凝。取全血100 μl，加入抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5（美國(guó)BECKMANNCOULTER公司）20μl，室溫下避光孵育10 min，加溶血素500 μl，15 min，加稀釋液500 μl，10 min后上流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECKMANN COULTER公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型）檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞百分比。

1.3外周血HBV DNA定量檢測(cè)抽取靜脈血2 ml，EDTA抗凝，采用熒光定量PCR法（美國(guó)ABI公司的7300型PCR儀）檢測(cè)血清HBV DNA（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。根據(jù)HBV DNA定量水平，將86例患者分為3組：HBV DNA陰性組（HBV DNA＜0.5 U/L），HBV DNA低載量組（HBV DNA為1×101～102U/L），HBV DNA高載量組（HBV DNA為1×103～105U/L）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS l3.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

HBV陰性組和低載量HBV DNA組外周血CD3+T細(xì)胞百分比比正常人降低，高載量HBV DNA組比低載量HBV DNA組明顯降低（P＜0.05）；HBV DNA低載量組和HBV陰性組CD4+T細(xì)胞百分比比正常人降低，HBV DNA高載量組降低更明顯（P＜0.05）；HBV DNA高載量組CD8+T細(xì)胞百分比比正常人有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；慢性HBV攜帶者外周血CD4+/CD8+細(xì)胞比值比正常人有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

3　討論

機(jī)體感染HBV后主要依靠細(xì)胞毒效應(yīng)與非細(xì)胞毒效應(yīng)兩種免疫機(jī)制消除病毒，其中 T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞毒效應(yīng)起主導(dǎo)作用。慢性乙型肝炎的發(fā)病主要是由于機(jī)體 T淋巴細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞免疫清除 HBV時(shí)引發(fā)了肝細(xì)胞的病理性損傷。因此 HBV感染的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與宿主細(xì)胞免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)［6，7］。研究認(rèn)為慢性HBV攜帶者常在幼年由于機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未健全或功能低下時(shí)，感染HBV后免疫系統(tǒng)不能有效識(shí)別病毒，造成攜帶狀態(tài)。臨床上，尚難打破慢性HBV攜帶者的免疫耐受狀態(tài)，如何治療HBV攜帶者也就成了被關(guān)注的熱點(diǎn)［8，9］。

表1　各組外周血T淋巴細(xì)胞百分比（%）的比較

T細(xì)胞膜表面分子基因主要以白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）、組織相容性抗原以及膜表面的受體等構(gòu)成。CD3+分子能表達(dá)于全部 T細(xì)胞上，是 T細(xì)胞共同的表面標(biāo)志［10，11］。所以，檢測(cè)CD3+淋巴細(xì)胞可反映T淋巴細(xì)胞的總數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比，HBV DNA陰性組、HBV DNA低載量組HBV攜帶者CD3+淋巴細(xì)胞百分比明顯降低，且差異具有顯著性，而HBV DNA高載量組與正常人比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明隨著HBV DNA水平的升高，HBV攜帶者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞總數(shù)也不斷增高，提示HBV攜帶者在病毒呈陰性或低載量時(shí)，機(jī)體參加細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞數(shù)不足，攜帶者細(xì)胞免疫未激活。

CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中起核心作用。CD4+亞群屬輔助性 T細(xì)胞（Th），可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，能輔助 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，也能輔助CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用；CD8+細(xì)胞可產(chǎn)生穿孔素等細(xì)胞毒物質(zhì)，參與抗腫瘤免疫、抗病毒和移植排斥反應(yīng)，歸屬于抑制性T細(xì)胞（Ts）［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比，HBV DNA陰性組、HBV DNA低載量組人群CD4+細(xì)胞百分比明顯降低，HBV DNA高載量組與正常人比，雖有所降低，但是無(wú)顯著性差異；HBV DNA陰性組、HBV DNA低載量組人群CD8+細(xì)胞百分比與正常人比有一定程度的降低，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而HBV DNA高載量組則呈增多狀態(tài)，但也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可見，HBV攜帶者免疫低下主要是由于CD4+淋巴細(xì)胞減少所致，從而導(dǎo)致免疫耐受狀態(tài)。

CD4與CD8的消長(zhǎng)平衡能反映促炎/抑炎因子的失衡及程度［6］。本研究結(jié)果顯示慢性HBV攜帶者CD4/CD8比值與正常人比有一定程度的降低，雖差異不顯著，但是隨病毒載量的升高，此比值也在不斷升高，表明患者體內(nèi)存在不同程度的CD4與CD8的失衡。

本研究結(jié)果顯示，HBV攜帶者體內(nèi)病毒載量低時(shí)，T淋巴細(xì)胞數(shù)量處于低下狀態(tài)，而患者病毒載量增高，T淋巴細(xì)胞數(shù)量也不斷增高，甚至與正常人差異不大，表明患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)處于活躍狀態(tài)，此時(shí)應(yīng)是清除病毒的時(shí)期，是否可以考慮當(dāng)患者體內(nèi)病毒載量升高時(shí)，對(duì)患者進(jìn)行抗病毒及各種免疫治療來(lái)達(dá)到清除病毒的目的，需要對(duì)患者體內(nèi)各類淋巴細(xì)胞的功能進(jìn)行詳細(xì)的了解，也將成為我們今后進(jìn)一步研究的方向。

【參考文獻(xiàn)】

［1］曾艷梅，張思泉，婁國(guó)強(qiáng)，等.替比夫定阻斷乙肝病毒宮內(nèi)感染的臨床研究.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15（4）:443-445.

［2］Zhang Y，Ren Y，Wu Y，et al.The L60V variation in hepatitis B virus core protein elicits new epitope-specific cytotoxic T lymphocytes and enhances viral replication.J Virol，2013，87 （7）:8075-8084.

［3］馬萍，宋詩(shī)鐸，王磊.阿德福韋治療對(duì)慢性乙型肝炎患者Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平及HBVDNA的影響.中國(guó)感染控制雜志，2011，10（1）:15-17.

［4］Zhu X，Chen L，F(xiàn)an W，et al.An intronic variant in the GRP78，a stress-associated gene，improves prediction for liver cirrhosis in persistent HBV carriers.PLoS One，2011；6（7）:e21997.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（2）：81-89.

［6］張小，兪海英，郭銀燕，等.阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎兒童外周血T淋巴細(xì)胞的變化.實(shí)用肝臟病雜志，2013，16（6）:546-547.

［7］Shrivastava S，Trehanpati N，Patra S，et al.Increased regulatory T cells and impaired functions of circulating CD8 T lymphocytes is associated with viral persistence in hepatitis B viruspositive newborns.J Viral Hepat，2013，20（8）：582-591.

［8］廖丹，張秀蘭，王滏，等.慢性乙型肝炎病毒攜帶者抗病毒治療的臨床療效觀察.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，7（3）:41-42

［9］Lee YH，Bae SC，Song GG，et al.Hepatitis B virus（HBV）reactivation in rheumaticpatientswithhepatitiscoreantigen （HBVoccultcarriers）undergoinganti-tumornecrosisfactor therapy.Clin Exp Rheumatol，2013，31（1）:118-121.

［10］詹輝，王劍松，武城闖，等.CD3+T淋巴細(xì)胞在膀胱癌腫瘤上皮與癌旁尿路上皮中的分布差異研究.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35 （1）:28-31.

［11］Bashour KT，Gondarenko A，Chen H，et al.CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.PNAS，2014，111（2）:2241-2246.

（收稿：2014-09-16）（

本文編輯：際宗炳）

第一作者：王慰，女，38歲，醫(yī)學(xué)學(xué)士，副主任醫(yī)師。主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療感染性疾病研究。E-mail：wwei1818@sina.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.019

*基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目（編號(hào)：20090607）

作者單位：050021石家莊市第五醫(yī)院肝病科（王慰，鄭歡偉，李兵順）；檢驗(yàn)科（楊莉）；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科（高恒波）

通訊作者：李兵順，E-mail：crb49lbs@163.com

Changes of T lymphocyte subsets in chronic hepatitis B virus carriers with different serum HBV DNA loads Wang Wei，Yang Li，Gao Hengbo，et al.Department of Liver Diseases，F(xiàn)ifth Hospital，Shijiazhuang 050021，HeBei Province

【Key words】Chronic hepatitis B virus carriers；T lymphocyte subsets；Flow cytometry；HBV DNA