李開(kāi)濟(jì)，魏靜波，駱廣玲，趙毓芳，閆 豐，呂翠平，甄永占*

(1.河北聯(lián)合大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)系， 河北 唐山 063000；2.開(kāi)灤醫(yī)療集團(tuán) 林西醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 河北 唐山 063000； 3.河北聯(lián)合大學(xué) 附屬醫(yī)院 腫瘤科， 河北 唐山 063000)

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賴氨大黃酸減輕D-半乳糖致衰老小鼠肝臟損傷

李開(kāi)濟(jì)1，魏靜波1，駱廣玲2，趙毓芳1，閆 豐3，呂翠平1，甄永占1*

(1.河北聯(lián)合大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)系， 河北 唐山 063000；2.開(kāi)灤醫(yī)療集團(tuán) 林西醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 河北 唐山 063000； 3.河北聯(lián)合大學(xué) 附屬醫(yī)院 腫瘤科， 河北 唐山 063000)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑:SPF級(jí)雄性昆明小鼠8～10周齡，體質(zhì)量34～36 g，[中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2007- 0001]；賴氨酸(北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心)；賴氨大黃酸 (rhein lysinate, RHL)由本室合成,分子式: C21H22N2O8，相對(duì)分子質(zhì)量430，純度98%；D-半乳糖，Amerresco；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)測(cè)定和HE(hematoxylin and eosin)染色試劑盒(均北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)。SIRT1、p16和p21抗體(Cell Signaling 公司)；β-actin(SC- 16)、抗兔二抗和抗小鼠二抗(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及肝臟處理：小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及衰老模型組，每組10只，每天腹部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，持續(xù)8周。低、高劑量RHL組分別每天1次灌胃25和50 mg/kg的RHL，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘眼球收集血，離心取血清，待測(cè)SOD和GSH-Px活性以及MDA含量。取肝臟待HE 染色及行肝臟組織MDA 含量與SOD 和GSH-Px 活性。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 肝組織MDA含量與SOD和GSH-Px活性測(cè)定：MDA含量采用硫代巴比妥酸法，SOD 活力采用聯(lián)苯三酚自氧化法，GSH-Px 活性采用NADPH耦聯(lián)法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 Western blot分析：BCA法測(cè)蛋白濃度。等量蛋白(40 μg)于10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，分別加入抗SIRT1(1∶1 000)、抗P21(1∶1 000)、抗P16(1∶1 000)及抗β-actin(1∶2 000)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌10 min×4次，用含辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5 000) 孵育1 h，洗膜15 min × 4次，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(santa cruz biotechnology SC-2048)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio-Rad公司Quantity One分析軟件測(cè)量條帶吸光度值，目的條帶與β-actin條帶吸光度值比值即為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況、體質(zhì)量及肝臟指數(shù):模型組小鼠明顯不喜活動(dòng)，毛色黯淡。不同劑量RHL組小鼠的靈活性和皮毛光澤較正常對(duì)照組雖有所下降，但比衰老模型組更靈活，皮毛更光澤。衰老模型組肝臟指數(shù)為(39.24±4.12)，明顯低于對(duì)照組(46.86±5.43)，與衰老模型組相比，RHL低、高劑量組肝臟指數(shù)顯著升高,分別為(44.76±4.89)和(45.64±3.65)。不同劑量的RHL組與對(duì)照組體質(zhì)量相比無(wú)明顯差異。

2.2 RHL對(duì)衰老模型小鼠血清和肝臟組織MDA含量與SOD和GSH-Px活性的影響:與對(duì)照組相比，衰老模型小鼠血清和肝臟SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，而MDA含量明顯升高(P<0.05)。25和50 mg/kg RHL治療后，顯著緩解模型組的變化(表1)。

通過(guò)合作研究[15]，基于投影圖像對(duì)小直徑銑削刀具狀態(tài)開(kāi)展了在線監(jiān)測(cè)研究，其原理如圖13所示。在激光傳感器感知刀具轉(zhuǎn)角位置信號(hào)后，通過(guò)PLC給CCD相機(jī)發(fā)出指令，相機(jī)隨即開(kāi)始拍照，獲得刀具的投影圖像。

2.3 RHL對(duì)衰老模型小鼠肝臟病理學(xué)改變的影響:與對(duì)照組相比，衰老模型小鼠肝組織可見(jiàn)明顯水腫，肝細(xì)胞中可見(jiàn)氣球樣變性。應(yīng)用25 mg/kg RHL治療后，水腫和少量肝細(xì)胞中可見(jiàn)氣球變性減輕。應(yīng)用50 mg/kg RHL治療后，未見(jiàn)明顯水腫和氣球樣變性。所有組別肝臟組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)都不明顯；肝板結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)明顯破壞(圖1)。

2.4 RHL對(duì)衰老模型小鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響:模型小鼠肝臟SIRT1的表達(dá)水平顯著下降，而P16和P21表達(dá)升高。用25和50 mg/kg RHL治療后，顯著緩解模型組的變化(圖2，表2)。

表1 RHL對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠血清及肝臟MDA、SOD和GSH-Px的影響

groupserumliverMDA(nmol/mL)SOD(U/mL)GSH?Px(U/mL)MDA(nmol/mgPro)SOD(U/mgPro)GSH?Px(U/mgPro)control326±045179±37688±36272±052261±53617±63model701±203?134±23?419±34?528±115?169±43?332±90?RHL(mg/kg)25489±134#166±21#655±28#421±089#197±38#444±82#RHL(mg/kg)50355±048#170±21#661±37#346±073#250±65#493±55#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group.

A.control group; B.model group; C.RHL 25 mg/kg group；D.RHL 50 mg/kg group

圖2 RHL對(duì)衰老模型小鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 2 The effect of RHL on the expression of the age-related gene in the liver of aging mice

groupSIRT1P16P21control100±14100±14100±19model31±3?276±18?193±28?RHL(mg/kg)2574±12#225±25?#176±33?RHL(mg/kg)5083±15#212±7?#100±21#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group.

3 討論

機(jī)體衰老時(shí)，體內(nèi)自由基和MDA含量升高，SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性下降。MDA作為一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，既是評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)之一，又可反映組織氧化的程度。

D-半乳糖可使機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的自由基，加速衰老[3]，本實(shí)驗(yàn)觀察到D-半乳糖模型小鼠肝臟指數(shù)、SOD及GSH-Px活性顯著降低，MDA的含量顯著增高。提示本實(shí)驗(yàn)的衰老小鼠模型是成功的。

本實(shí)驗(yàn)觀察到RHL能顯著提高衰老模型小鼠血清的SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，具有明顯的抗衰老作用。其機(jī)理可能與清除體內(nèi)自由基，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

腹腔注射D-半乳糖可以使肝臟組織SIRT1蛋白表達(dá)下降、P21和P16蛋白表達(dá)升高。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是NAD-依賴性去乙?；福苎泳彽偷壬锼ダ虾蜏p少哺乳動(dòng)物衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。許多的證據(jù)表明哺乳動(dòng)物SIRT1的活性升高可以減緩衰老和降低衰老相關(guān)的疾病的發(fā)生[4]

P16基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在大多數(shù)嚙齒類動(dòng)物和人類中，隨著機(jī)體的衰老，P16基因的表達(dá)顯著增加。P21基因也隨著年齡的增長(zhǎng)表達(dá)增加。

RHL具有改善肝臟組織抗氧化能力的作用，可提高肝臟組織SOD和GSH-Px的酶活性，降低肝臟組織MDA含量，RHL還有增加肝臟組織沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)蛋白的表達(dá)水平，減少P21和P16表達(dá)的作用。

總之，RHL能抑制氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞氣球樣變性和調(diào)控肝臟組織衰老相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)衰老小鼠肝臟的保護(hù)作用。RHL有望成為預(yù)防衰老的藥物。

[1] Zhong XF, Huang GD, Luo T,etal. Protective effect of rhein against oxidative stress-related endothelial cell injury [J]. Mol Med Rep, 2012, 5:1261- 1266.

[2] Lin YJ, Zhen YZ, Wei J,etal. Effects of Rhein lysinate on H2O2-induced cellular senescence of human umbilical vascular endothelial cells [J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32: 1246- 1252.

[3] Chen HL, Wang CH, Kuo YW,etal. Antioxidative and hepatoprotective effects of fructo-oligosaccharide in D-galactose-treated Balb/cJ mice [J]. Br J Nutr, 2011,105, 805- 809.

[4] Herskovits AZ, Guarente L. SIRT1 in neurodevelopment and brain senescence [J]. Neuron. 2014, 81:471- 483.

新聞點(diǎn)擊

睡眠有助腦排毒

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年10月18日?qǐng)?bào)道，美國(guó)羅徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(University of Rochester)發(fā)表在《科學(xué)》(Science)期刊上的最新研究發(fā)現(xiàn)，腦部會(huì)利用睡眠時(shí)間進(jìn)行排毒。

根據(jù)研究人員對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)，睡眠時(shí)腦細(xì)胞會(huì)收縮，使細(xì)胞之間的空間擴(kuò)大，神經(jīng)元彼此間的空間平均增加60%；在腦內(nèi)顱骨與大腦皮質(zhì)之間，蛛網(wǎng)膜下腔中腦脊液的量會(huì)增加，快速流動(dòng)并通過(guò)血管進(jìn)行排毒，廢棄物質(zhì)會(huì)進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)，最后到達(dá)肝臟。

由于是大腦膠質(zhì)細(xì)胞在運(yùn)作，且非常類似身體的淋巴系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)將這套腦部運(yùn)作系統(tǒng)命名為“膠狀淋巴系統(tǒng)”(Glymphatic System)，其在睡眠時(shí)的運(yùn)作速度比清醒時(shí)快了10倍。

這項(xiàng)針對(duì)大鼠腦部的研究由研究員尼德佳德(Dr. Maiken Nedergaard)博士所帶領(lǐng)，她認(rèn)為，人類的腦部也會(huì)在睡眠時(shí)清除有毒物質(zhì)，而下一步就研究人類大腦在此過(guò)程的運(yùn)動(dòng)機(jī)制。

尼德佳德博士指出，腦部運(yùn)作的能量有限，只能在清醒與睡眠中選擇其中一種。而在睡眠時(shí)是為了清理廢棄物質(zhì)，這也是為何睡眠如此重要的原因。但若腦部沒(méi)有充分排毒，可能導(dǎo)致部分有毒的蛋白質(zhì)殘留，造成腦部疾病。例如阿爾茨海默病就是因?yàn)槟X部積聚太多乙型淀粉樣蛋白(beta amyloid)所導(dǎo)致。

2014-09 - 09

2014- 12- 26

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001439)；河北省科技廳自然科學(xué)基金(H2012401030)；河北聯(lián)合大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(X2014078)

1001-6325(2015)04-0523-03

R339- 34

A

*通信作者(corresponding author)：yongzhanzhen@126.com