宋永輝

(黑龍江省大慶油田總醫(yī)院 兒科, 黑龍江 大慶 163319)

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研究論文

厚樸酚減輕缺血大鼠心肌損傷

宋永輝*

(黑龍江省大慶油田總醫(yī)院 兒科, 黑龍江 大慶 163319)

目的研究厚樸酚(Mag)對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法SD大鼠分為對(duì)照組、模型組和厚樸酚組。模型組采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立急性心肌梗死模型。Mag組建模型前預(yù)先30 min給予高、中和低3種濃度的厚樸酚(40、20和10 mg/kg)。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活 力 和 丙 二 醛(MDA)含量，DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)Bcl- 2、caspase- 3和Bax蛋白表達(dá)，激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)[Ca2+]i。結(jié)果1)模型組LVEDP較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。Mag組(40 mg/kg) LVEDP較模型組顯著降低(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax較模型組顯著增加(P<0.05)。2)模型組Bcl- 2表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，30 mmol/L KCl誘導(dǎo)的[Ca2+]i、Bax及caspase- 3表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。Mag組(40 mg/kg)Bcl- 2表達(dá)水平較模型組顯著增加(P<0.05)，30 mmol/L KCl誘導(dǎo)的[Ca2+]i、Bax及caspase- 3表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論厚樸酚減輕大鼠缺血心肌損傷可能與下調(diào)[Ca2+]i和抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

厚樸酚; 心肌缺血; Bcl- 2；Bax；caspase- 3

缺血性心臟病亦稱冠心病，是發(fā)病率高且危害嚴(yán)重的心臟病，心肌缺血后心肌細(xì)胞的凋亡與心室重構(gòu)是導(dǎo)致心功能降低、心力衰竭和惡性心律失常的重要原因。目前，對(duì)于心肌缺血導(dǎo)致的心肌損害，仍然缺乏有效的防治措施。厚樸酚(magnolol, Mag)是從中藥厚樸(magnoliaofficinalis rehder et. Wilson)中提取的一種含有酚羥基的活性物質(zhì)。它具有抗炎及抗自由基[1]等藥理作用。厚樸酚可減少兔視網(wǎng)膜缺血再灌注神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能是促進(jìn)抗凋亡Bcl- 2表達(dá)，抑制促凋亡caspase- 3蛋白表達(dá)[2]。提示厚樸酚對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)鈣，抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。本文探討厚樸酚對(duì)缺血大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠，200～250 g(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)字第0921號(hào))。厚樸酚注射液(純度98%，南京澤朗生物有限公司)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所；膠原蛋白酶Ⅱ，牛血清清蛋白(BSA)，HEPES，EGTA(Sigam公司)；Fluo- 3AM(Invitrogen公司)。原位末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司)。Bcl- 2，Bax，甘油醛- 3-磷酸脫氫酶抗體(Cell signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定：大鼠腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)，麻醉后仰位固定，建立心肌缺血模型[5]。假手術(shù)組，穿線不結(jié)扎；模型組，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；給藥組舌下靜脈注射高、中和低劑量(40、20和10 mg/kg)厚樸酚注射液，30 min后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎6 h后，測(cè)左心室舒張末期壓(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室內(nèi)壓上升/下降最大速率(±dp/dt)。

1.2.2 心肌梗死面積的測(cè)定：結(jié)扎6 h后立即取出心臟，剪下左心室，每隔2 mm將心肌橫切成緣片，應(yīng)用TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積。

1.2.3 血清SOD活力和MDA含量的測(cè)定：結(jié)扎6 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心制備血清，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活力和MDA含量。

1.2.4 凋亡指數(shù)的檢測(cè)：結(jié)扎6 h后，取左心室心肌，10%甲醛固定，常規(guī)組織切片，采用原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，在高倍視野(×400)下，每張切片于梗死區(qū)周圍選擇8個(gè)無(wú)重疊視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞核數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)：組織勻漿裂解后取心肌總蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將凝膠電泳分離的蛋白分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后將膜封閉2 h。用Bcl- 2、Bax 及caspase- 3(1:1 000)的單克隆抗體對(duì)膜密閉，于4 ℃冰箱過(guò)夜，用1∶5 000稀釋的紅外熒光標(biāo)記二抗對(duì)膜避光孵育1 h。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對(duì)膜上蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH吸度值的比值，表示蛋白的相對(duì)水平。

1.2.6 [Ca2+]i的測(cè)定：迅速開胸取出麻醉大鼠心臟。心肌細(xì)胞分離及染色過(guò)程見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波長(zhǎng)為48 8nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，20×物鏡下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[Ca2+]i的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Mag對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

模型組LVEDP較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，Mag組(40mg/kg)上述指標(biāo)變化顯著減少(P<0.05)(表 1)。

2.2 Mag對(duì)心肌缺血大鼠心肌梗死面積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積明顯增大(P<0.05)。Mag(40 mg/kg)組明顯回降，但仍高于對(duì)照(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響Table 1 Effect of Mag on hemodynamics in cardiac ischemic rat (n=8)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model.

Shown are mean data of infarct size from 10 rats圖1 Mag對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響Fig 1 Effects of Mag on myocardial infarct size of the rats

2.3 Mag對(duì)心肌缺血大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

模型組血清SOD活力較對(duì)照組明顯降低(P<0.05),MDA水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。Mag組(4 0mg/kg)上述指標(biāo)改變被逆轉(zhuǎn)(P<0.05)(表2)。

表2 Mag對(duì)急性缺血大鼠氧化應(yīng)激的影響Table 2 Effect of Mag on the SODactivity and MDA level in serum of rats(n=8)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model.

2.4 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

假手術(shù)組僅少量心肌細(xì)胞凋亡，胞核呈藍(lán)色。模型組大量心肌細(xì)胞凋亡，凋亡的心肌細(xì)胞核呈棕褐色，Mag組(40 mg/kg)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)(圖2)。

2.5 Mag對(duì)KCl介導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞 [Ca2+]i升高的影響

心肌缺血細(xì)胞與正常大鼠心肌細(xì)胞相比[Ca2+]i明顯增加， KCl(30 mmol/L)使缺血心肌細(xì)胞[Ca2+]i進(jìn)一步增加(P<0.05)。Mag(100 μmol/L)可以明顯降低KCl(30 mmol/L)介導(dǎo)缺血心肌細(xì)胞[Ca2+]i升高(P<0.05)(圖3)

2.6 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌組織Bcl- 2蛋白、Bax蛋白及caspase- 3蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組Bax、caspase- 3蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl- 2蛋白水平降低(P<0.05)。給予Mag(40 mg/kg)后，Bax及caspase- 3蛋白水平顯著低于模型組(P<0.05)，Bcl- 2蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05) (圖4，表3)。

3 討論

氧化應(yīng)激損傷，是心肌缺血時(shí)重要的損傷途徑之一。其損傷的程度可通過(guò)內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性及MDA水平的變化間接評(píng)定。本實(shí)驗(yàn)表明，Mag能縮小結(jié)扎大鼠心肌梗死范圍，提高血清SOD活力，降低MDA水平，提示Mag可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，并提高內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性而減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血性心肌損傷的重要因素。

A,B,C.images of TUNEL staining, D.mean data of positive TUNEL staining from eight rats for each group;*P<0.05 compared with control;#P<0.01 compared with model

圖2 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

Fig 2 Effects of Mag on rat cardiomyocytes apoptosis determined by TUNEL staining(×40)

A.cardiomyocytes；B.ischamic cardiomyocytes; C.ischamic cardiomyocytes+KCl；D.ischamic cardiomyocytes+KCl+Mag(×40);*P<0.05 compared with normal cardiomyocytes;#P<0.05 compared with ischamic cardiomyocytes;△P<0.05 compared with ischamic cardiomyocytes incubated with KCl

圖3 Mag對(duì)KCl介導(dǎo)的急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響Fig 3 Effect of Mag on [Ca2+]i elevation induced by KCl of rat cardiomyocytes in Tyrode solution (n=5) 表3 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠Bcl- 2、Bax及caspase- 3蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effects of Mag on the expression of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 protein in rats(n=8)

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

圖4 Mag對(duì)急性心肌缺血大鼠Bcl- 2、Bax及caspase- 3蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of Mag on the express of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 protein in rats

細(xì)胞凋亡的發(fā)生與Bcl- 2/Bax這一對(duì)凋亡調(diào)控基因的表達(dá)水平密切相關(guān)[4]。Caspases是白介素1 轉(zhuǎn)化酶樣蛋白酶。家族某一成員的激活都會(huì)將caspases激活，最終引起細(xì)胞凋亡，故有人將caspases稱為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[5]。本研究表明，缺血6 h后，在模型組梗死心肌周圍出現(xiàn)了凋亡的心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較假手術(shù)組明顯增加，而Mag對(duì)心肌缺血所誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，能明顯降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。Mag還能使缺血心肌的Bcl- 2表達(dá)明顯增加，Bax及caspase- 3表達(dá)明顯降低。提示Mag對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用可能部分是通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

在心肌缺血過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i超載是引起心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。本文顯示，Mag可以降低心肌細(xì)胞[Ca2+]i，說(shuō)明其心肌保護(hù)作用可能與減少心肌缺血時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

綜上所述，Mag對(duì)大鼠缺血心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)心肌細(xì)胞[Ca2+]i，抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Magnolol relieves ischemic myocardial injuries of rats

SONG Yong-hui*

(Dept. of Pediatrics, Heilongjiang Daqing Oil Field General Hospital, Daqing 163319, China)

Objective To explore the possible role of magnolol in myocardial ischemic damage and potential signaling pathways as potential mechanisms. Methods The protective properties of magnolol were studied in rat model of acute myocardial infarction due to permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. MDA content and SOD activity was measured by ELISA method. Apoptosis of cardiomyocytes was also observed by TUNEL staining.The expression of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 were examined by Western blot.Intracellular calcium concentration [Ca2+]iwas tested Laser scanning confocal microscopy. Results Administration of magnolol relieved myocardial injuries during ischemia, and this were achieved by protecting cardiomyocytes from apoptotic death. The beneficial effects of magnolol were likely mediated by activation of the survival signaling molecule (Bcl- 2), and a reduction of apoptotic mediator (Bax, caspase- 3) and intracellular Ca2+overload. Conclusions Administration of magnolol relieved myocardial injuries during ischemia, and this is achieved by protecting cardiomyocytes from apoptotic death.

magnolol; myocardial ischemic; Bcl- 2；Bax；caspase- 3

2014- 06- 30

2015- 01- 09

1001-6325(2015)04-0518-05

R542.2+2

A

*通信作者(corresponding author)：565339199@qq.com